Генетика- науката никак не е млада, изследванията в нея се провеждат от няколко века, като се започне от Мендел през 1865 г. и до днес. Терминът "ген" за единица с наследствена характеристика е предложен за първи път от Йохансен през 1911 г., а през 40-те години на миналия век е усъвършенстван от концепцията за "един ген - един ензим", предложена от Тейтъм и Бийдъл.

Тази позиция е определена в експерименти върху мухи Drosophila, но в еднаква степен се отнася и за хората; В крайна сметка животът на всички същества се определя от тяхната ДНК. Молекулата на ДНК при хората е по-голяма, отколкото във всички други организми, и е по-сложна, но същността на нейните функции е една и съща за всички живи същества.

концепция " един ген - един ензим“, възникнал въз основа на идеите на Тейтъм и Бийдъл, може да се формулира по следния начин:
1. Всички биологични процеси са под генетичен контрол.
2. Всички биохимични процеси протичат под формата на поетапни реакции.
3. Всяка биохимична реакция в крайна сметка се контролира от различни отделни гени.
4. Мутация в определен ген води до промяна в способността на клетката да извършва определена химична реакция.

Оттогава концепцията за "един ген - един ензим" се разшири донякъде и сега звучи като " един ген - един протеин". В допълнение, последните изследвания показват, че някои гени работят съвместно с други, за да произвеждат уникални протеини, което означава, че някои гени могат да кодират повече от един протеин.

човешки геномсъдържа около 3 милиарда нуклеотидни двойки; смята се, че съдържа от 50 000 до 100 000. След дешифрирането на генома се оказа, че гените са само около 30 000. Взаимодействието на тези гени е много по-сложно от очакваното. Гените са кодирани в ДНК вериги, които в комбинация с определени ядрени протеини образуват хромозоми.

гени- не само сегменти от ДНК: те се образуват от кодиращи последователности - екзони, разпръснати с некодиращи последователности - интрони. Екзоните, като експресирана част от ДНК, са само малка част от най-важната молекула на организма; по-голямата част от него не се експресира, образува се от интрони и често се нарича "тиха" ДНК.

Приблизителен размер и структура човешки геномпоказано на фигурата по-долу. Функционалната дължина на човешката хромозома се изразява в сентиморганиди. Centimorganide (cm) - разстоянието, през което вероятността за преминаване по време на мейоза е 1%. Анализът на генната връзка показва, че дължината на човешкия геном е около 3000 cM.

Среден хромозомасъдържа приблизително 1500 гена, кодирани в 130 милиона базови двойки. Фигурата по-долу показва схематично физическите и функционалните размери на генома: първият е изчислен в нуклеотидни двойки, а вторият е в cM. По-голямата част от човешкия геном е представена от "тиха" ДНК и не се експресира.

На ДНК шаблонВ резултат на процеса на транскрипция се синтезира РНК, а след това и протеин. Следователно последователността на ДНК напълно определя последователността на функционалните протеини на клетката. Всички протеини се синтезират по следния начин:
ДНК => РНК => протеин

Генетичният апарат на хората и другите бозайници е по-сложен от този на други живи организми, тъй като части от някои гени при бозайници могат да се комбинират с части от други гени, което води до синтеза на изцяло нов протеин или контрола на определена клетъчна функция.

Следователно е възможно човек да увеличи броя на експресираните гени, без реално да увеличава количеството на експресираните гени. ДНКили абсолютния брой гени.
Като цяло около 70% от целия генетичен материал не е експресиран.

Откритията на екзон-интронната организация на еукариотните гени и възможността за алтернативно сплайсинг показват, че една и съща нуклеотидна последователност на първичния транскрипт може да осигури синтеза на няколко полипептидни вериги с различни функции или техни модифицирани аналози. Например, митохондриите на дрожди съдържат гена box (или cob), кодиращ респираторния ензим цитохром b. Той може да съществува в две форми: „Дългият“ ген, състоящ се от 6400 bp, има 6 екзона с обща дължина от 1155 bp. и 5 интрона. Кратката форма на гена се състои от 3300 bp. и има 2 интрона. Това всъщност е "дълъг" ген, лишен от първите три интрона. И двете форми на гена са еднакво добре изразени.

След отстраняването на първия интрон от гена на „дългата“ кутия, въз основа на комбинираната нуклеотидна последователност на първите два екзона и част от нуклеотидите на втория интрон, се образува шаблон за независим протеин, РНК матураза (фиг. 3.43). Функцията на РНК матуразата е да осигури следващия етап на сплайсинг - отстраняването на втория интрон от първичния транскрипт и в крайна сметка образуването на шаблон за цитохром b.

Друг пример е промяна в модела на сплайсинг на първичния транскрипт, кодиращ структурата на молекулите на антитялото в лимфоцитите. Мембранната форма на антителата има дълга "опашка" от аминокиселини в С-края, което осигурява фиксирането на протеина върху мембраната. Секретираната форма на антитела няма такава опашка, което се обяснява с отстраняването на нуклеотиди, кодиращи тази област, от първичния транскрипт по време на сплайсинга.

При вируси и бактерии е описана ситуация, при която един ген може едновременно да бъде част от друг ген или някаква ДНК нуклеотидна последователност може да бъде част от два различни припокриващи се гена. Например, на физическата карта на генома на фага FX174 (фиг. 3.44) може да се види, че последователността на В гена се намира вътре в гена А, а генът Е е част от генната последователност D. Тази характеристика на организация на фаговия геном успя да обясни съществуващото несъответствие между неговия относително малък размер (състои се от 5386 нуклеотида) и броя на аминокиселинните остатъци във всички синтезирани протеини, което надвишава теоретично допустимия за даден капацитет на генома. Възможността за сглобяване на различни пептидни вериги върху иРНК, синтезирана от припокриващи се гени (A и B или E и D), се осигурява от наличието на рибозомни свързващи места в тази иРНК. Това позволява транслацията на друг пептид да започне от нова референтна точка.

Нуклеотидната последователност на В гена също е част от А гена, а Е генът е част от D гена.

В генома на λ фага бяха открити и припокриващи се гени, преведени както с изместване на рамката, така и в една и съща рамка на четене. Предполага се също, че две различни иРНК могат да бъдат транскрибирани от двете комплементарни вериги на една и съща ДНК област. Това изисква наличието на промоторни области, които определят движението на РНК полимеразата в различни посоки по протежение на ДНК молекулата.

Описаните ситуации, които свидетелстват за допустимостта на четенето на различна информация от една и съща ДНК последователност, предполагат, че припокриващите се гени са доста често срещан елемент в организацията на генома на вирусите и евентуално на прокариотите. При еукариотите прекъсването на гените също позволява синтеза на различни пептиди на базата на една и съща ДНК последователност.

Имайки предвид всичко това, е необходимо да се промени определението за ген. Очевидно вече не може да се говори за ген като за непрекъсната последователност от ДНК, която уникално кодира специфичен протеин. Очевидно в момента формулата "Един ген - един полипептид" все още трябва да се счита за най-приемлива, въпреки че някои автори предлагат да се промени: "Един полипептид - един ген". Във всеки случай под термина ген трябва да се разбира функционална единица от наследствен материал, който по своята химическа природа е полинуклеотид и определя възможността за синтезиране на полипептидна верига, тРНК или рРНК.

Един ген един ензим.

През 1940 г. Дж. Бийдъл и Едуард Тейтъм използват нов подход за изследване как гените осигуряват метаболизма в по-удобен обект на изследване - микроскопичната гъба Neurospora crassa .. Те получават мутации, при които; нямаше активност на един или друг метаболитен ензим. И това доведе до факта, че мутантната гъба не е в състояние да синтезира сам определен метаболит (например аминокиселината левцин) и може да живее само когато левцинът се добавя към хранителната среда. Теорията "един ген - един ензим", формулирана от Дж. Бийдъл и Е. Тейтъм, бързо получава широко признание сред генетиците, а самите те са удостоени с Нобелова награда.

Методи. Изборът на така наречените "биохимични мутации", които водят до нарушаване на действието на ензимите, осигуряващи различни метаболитни пътища, се оказа много ползотворен не само за науката, но и за практиката. Първо, те доведоха до появата на генетиката и селекцията на индустриални микроорганизми, а след това и до микробиологичната индустрия, която използва щамове микроорганизми, които свръхпродуцират такива стратегически важни вещества като антибиотици, витамини, аминокиселини и др. Принципите на селекцията и генното инженерство на щамове свръхпроизводители се основават на идеята, че "един ген кодира един ензим". И въпреки че тази идея е отлична практика, носи многомилионни печалби и спасява милиони животи (антибиотици) - тя не е окончателна. Един ген не е само един ензим.

"

1. Генът е част от ДНК молекула, която е функционална единица от наследствена информация.

1. Генът заема определена област в хромозомата – локуса.

2. Рекомбинация може да се случи в рамките на ген.

3. ДНК, която е част от гена, е способна да се ремонтира.

4. Има гени: структурни, регулаторни и т.н.

5. Подреждането на триплетите е комплементарно към аминокиселините (мутации с изместване на рамката на четене).

6. Генотипът, бидейки дискретен (състоящ се от отделни гени), функционира като едно цяло.

7. Генетичният код е универсален.

8. Генетичният код е изроден (за много аминокиселини има повече от един кодон - сайт)

9. Гените са подредени в линеен ред на хромозомата и образуват група за свързване. Броят на групите за свързване съответства на хаплоидния набор от хромозоми (23 при хората или 24 с резервация за пола - x и y хромозоми).

Структурата на протеините се определя от набора и реда на аминокиселините в техните пептидни вериги. Именно тази последователност от аминокиселини в пептидите е криптирана в ДНК молекули с помощта на генетичния код.

Свойства на генетичния код:

1. Тройност-всяка аминокиселина е кодирана от три съседни нуклеотида.
2. дегенерация-много аминокиселини са криптирани с няколко триплета.
3. Специфичност- всеки триплет може да кодира само една специфична аминокиселина.
4. Универсалност- пълно съответствие на кода с различни видовеживи организми.
5. Приемственост- нуклеотидните последователности се четат тройно по тройно без празнини.
6. Неприпокриващи се кодони- съседните тризнаци не се припокриват.

20. Рибозомен цикъл на протеинов синтез (иницииране, удължаване, терминация). Пост-транслационни трансформации на протеини.

Наследствената информация, записана с помощта на генетичния код, се съхранява в молекулите на ДНК, но пряко участиев поддържането на живота на клетката, тя не приема. Ролята на посредник, чиято функция е да преведе наследствената информация, съхранявана в ДНК, в работеща форма, играе РНК. Процесът на взаимодействие между тРНК и тРНК, който осигурява превода на информация от езика на нуклеотидите на езика на аминокиселините, се извършва върху рибозомите. Рибозомните РНК са не само структурен компонент на рибозомите, но също така осигуряват тяхното свързване със специфична нуклеотидна последователност на иРНК. Това установява началото и рамката на четене по време на образуването на пептидната верига. Освен това те осигуряват взаимодействие между рибозомата и tRNA. Рибозомите имат 2 канала. Едната от тях държи растящата полипептидна верига, другата иРНК. В допълнение, 2 tRNA-свързващи места са изолирани в рибозоми. Аминоацил-тРНК се намира в аминоацил, А-место, носещ специфична аминокиселина. В пептидилната, P-секция, обикновено се намира tRNA. Образуването на А- и Р-места се осигурява от двете субединици на рибозомата. Преводът може да бъде разделен на три фази: започване, удължаване и прекратяване.

Фаза на започванесе състои в комбиниране на две субчастици на рибозомата, които преди това са били разделени в цитоплазмата на определено място на иРНК и прикрепване на първата аминоацил-тРНК към нея. Това също така задава рамката за четене на информация, съдържаща се в иРНК.

фаза на удължаванеили удължаване на пептида, включва всички реакции от момента на образуване на първата пептидна връзка до прикрепването на последния amk. Това е циклично повтарящо се събитие, при което има специфично разпознаване на следващия кодон аминоацил-тРНК, разположен в А-места, комплементарно на връзката между антикодона и кодона. Фаза на прекратяване или завършването на полипептидния синтез, е свързано с разпознаването на един от терминиращите кодони (UAA, UAG, UGA) от специфичен рибозомен протеин, когато той навлезе в зоната на А-места на рибозомата. В този случай водата е прикрепена към последния amc в пептидната верига и нейният карбоксилен край се отделя от tRNA. В резултат на това завършената пептидна верига губи връзката си с рибозомата, която се разпада на две субчастици.

Пост-транслационна трансформация на протеини.Пептидните вериги, синтезирани по време на транслацията, въз основа на тяхната първична структура, придобиват вторична и третична, а много и четвъртична организация, образувана от няколко пептидни вериги. В зависимост от функциите, изпълнявани от протеините, техните аминокиселинни последователности могат да претърпят различни трансформации, образувайки функционално активни протеинови молекули. Много мембранни протеини се синтезират като предварителни протеини с водеща последователност в N-края, която им осигурява мембранно разпознаване. Секреторните протеини също имат водеща последователност в N-края, която осигурява транспортирането им през мембраната. Някои протеини непосредствено след транслацията носят допълнителни аминокиселинни про-последователности, които определят стабилността на активните протеинови прекурсори. По време на съзряването на протеина те се отстраняват, което позволява прехода на неактивния пропротеин към активния протеин. Образувайки третична и кватернерна организация в хода на посттранслационните трансформации, протеините придобиват способността да функционират активно, включвайки се в определени клетъчни структури и изпълнявайки ензимни и други функции.

Връзката между ген и черта. Хипотезата "един ген - един ензим", нейната съвременна интерпретация: "един ген - една полипептидна верига"

ген - участък от ДНК молекула, който носи информация за структурата на полипептидна верига или макромолекула. Гените на една хромозома са подредени линейно, образувайки група за свързване. ДНК в хромозомата изпълнява различни функции. Гените са малки по размер, въпреки че се състоят от хиляди базови двойки. Наличието на ген се установява от проявата на признака на гена (краен продукт).

За Мендел генът е само символ, удобен за дефиниране на закона за наследяването. Връзката между ген и черта (продукт) е открита при изследване на ферментацията в безвъздушна среда - 1902 Garrod. Той изучава родословията на пациенти с алкаптонурия, стига до заключението, че заболяването е резултат от нарушение на азотния метаболизъм, докато. Вместо урея се образува тъмно вещество. Със съдействието на прилепите през 1908 г. се предполага, че заболяването се среща при рецесивни хомозиготи, които нямат някакъв вид ензимна реакция, което води до натрупване и отделяне на субстрата, който обикновено трябва да бъде разделен. Човешката кръв съдържа хомогентизинова киселина, но обикновено тя се разгражда от оксидаза на хомогентизинова киселина до малеинов ацетат, след това до вода и въглероден диоксид. Пациентите нямат оксидаза, така че киселината се натрупва и се отделя с урината.

Албинизмът също се предава по наследство, въпреки че се среща много по-често. При това заболяване няма ензим, който превръща тирозина в меланин.

До 1940 г. мнението на учените беше разделено, но нямаше теория. 1940 г. - Бийдъл и Тейтъмхипотеза: 1 ген - 1 ензим. Етази хипотеза изигра важна роля - учените започнаха да разглеждат крайните продукти. Оказа се, че хипотезата има ограничения, т.к Всички ензими са протеини, но не всички протеини са ензими. По правило протеините са олигомери – т.е. съществуват в кватернерна структура. Например, капсула от тютюнева мозайка има над 1200 полипептида. В момента най-приемливата хипотеза е "Един ген - един полипептид".Терминът ген трябва да се разбира като функционална единица на наследствеността, според химическа природакойто е полинуклеотид и определя възможността за синтезиране на полипептидна верига.

Генът като единица за променливост. Генни мутации и тяхната класификация. Причини и механизми на генни мутации. Последици от генни мутации.

Генът е елементарна единица от наследствен материал. Генни мутациисвързани с промяна във вътрешната структура на гените, която превръща един алел в друг.

Промените в структурата на ДНК, която образува гена, могат да бъдат разделени на 3 групи.

Във всяка жива клетка протичат много химични реакции. Ензимите (ензимите) са протеини със специални и изключително важни функции. Те се наричат ​​биокатализатори. Основното нещо в тялото е да се ускорят биохимичните реакции. Първоначалните реагенти, чието взаимодействие се катализира от тези молекули, се наричат ​​субстрати, а крайните съединения се наричат ​​продукти.

В природата ензимните протеини работят само в живите системи. Но в съвременната биотехнология, клиничната диагностика, фармацевтиката и медицината се използват пречистени ензими или техни комплекси, както и допълнителни компоненти, необходими за работата на системата и визуализацията на данните за изследователя.

Биологично значение и свойства на ензимите

Без тези молекули живият организъм не би могъл да функционира. Всички жизнени процеси работят хармонично благодарение на ензимите. Основната функция на протеин-ензимите в организма е регулирането на метаболизма. Без тях нормалният метаболизъм е невъзможен. Регулирането на активността на молекулите става под действието на активатори (индуктори) или инхибитори. Контролът действа на различни нива на протеинов синтез. Той също така "работи" по отношение на готова молекула.

Основните свойства на протеин-ензимите - специфичност към конкретен субстрат. И съответно способността да се катализира само една или по-рядко редица реакции. Обикновено такива процеси са обратими. Един ензим е отговорен и за двете функции. Но това не е всичко.

Ролята на ензимните протеини е от съществено значение. Без тях биохимичните реакции не протичат. Благодарение на действието на ензимите става възможно реагентите да преодолеят активационната бариера без значителен разход на енергия. В тялото няма начин да се загрее температура над 100°C или да се използват агресивни компоненти като химическа лаборатория. Ензимният протеин се свързва със субстрата. В свързано състояние се извършва модификация с последващо освобождаване на последното. По този начин работят всички катализатори, използвани в химическия синтез.

Какви са нивата на организация на протеин-ензимна молекула?

Обикновено тези молекули имат третична (глобула) или кватернерна (няколко свързани глобули) протеинова структура. Първо, те се синтезират в линейна форма. И след това те се сгъват в необходимата структура. За да осигури активност, биокатализаторът изисква определена структура.

Ензимите, подобно на други протеини, се разрушават от топлина, екстремни стойности на pH, агресивни химични съединения.

Допълнителни свойства на ензимите

Сред тях се разграничават следните характеристики на компонентите:

1. Стереоспецифичност - образуването само на един продукт.
2. Региоселективност - Gap химическа връзкаили промяна на групата само в една позиция.
3. Хемоселективността е катализа само на една реакция.

Характеристики на работата

Нивото варира. Но всеки ензим винаги е активен по отношение на специфичен субстрат или група съединения, сходни по структура. Непротеиновите катализатори нямат това свойство. Специфичността се измерва чрез константата на свързване (mol/l), която може да бъде до 10 -10 mol/l. Работата на активния ензим е бърза. Една молекула катализира хиляди до милиони операции в секунда. Степента на ускоряване на биохимичните реакции е значително (1000-100000 пъти) по-висока от тази на конвенционалните катализатори.

Действието на ензимите се основава на няколко механизма. Най-простото взаимодействие се осъществява с една молекула на субстрата, последвано от образуването на продукт. Повечето ензими са в състояние да свържат 2-3 различни молекули, които реагират. Например, прехвърляне на група или атом от едно съединение в друго, или двойно заместване според принципа на "пинг-понг". При тези реакции обикновено единият субстрат се комбинира, а вторият е свързан чрез функционална група с ензима.

Изследването се извършва по следните методи:

1. Дефиниции на междинни и крайни продукти.
2. Проучване на геометрията на структурата и функционалните групи, свързани със субстрата и осигуряващи високо
3. Мутации на ензимни гени и определяне на промените в неговия синтез и активност.

Активен и обвързващ център

Субстратната молекула е много по-малка от ензимния протеин. Следователно, свързването се осъществява поради малък брой функционални групи на биокатализатора. Те образуват активен център, състоящ се от специфичен набор от аминокиселини. В структурата има протетична група с непротеинов характер, която също може да бъде част от активния център.

Трябва да се разграничи отделна група ензими. Тяхната молекула съдържа коензим, който постоянно се свързва с молекулата и се освобождава от нея. Напълно образуваният ензимен протеин се нарича холоензим, а когато кофакторът се отстрани, се нарича апоензим. Витамините, металите, производните на азотните основи често действат като коензими (NAD - никотинамид аденин динуклеотид, FAD - флавин аденин динуклеотид, FMN - флавин мононуклеотид).

Мястото на свързване осигурява специфичност на афинитета към субстрата. Благодарение на него се образува стабилен субстрат-ензимен комплекс. Структурата на глобулата е изградена по такъв начин, че на повърхността да има ниша (процеп или вдлъбнатина) с определен размер, която осигурява свързването на субстрата. Тази зона обикновено се намира недалеч от активния център. Някои ензими имат места за свързване с кофактори или метални йони.

Заключение

Протеиновият ензим играе важна роля в организма. Такива вещества катализират химичните реакции, отговарят за процеса на обмяната на веществата - метаболизма. Във всяка жива клетка непрекъснато протичат стотици биохимични процеси, включително реакции на редукция, разцепване и синтез на съединения. Окисляването на веществата се случва постоянно с голямо освобождаване на енергия. Той от своя страна се изразходва за образуването на въглехидрати, протеини, мазнини и техните комплекси. Продуктите на разцепването са структурни елементи за синтеза на необходимите органични съединения.

4.2.1. Един ген, една ензимна хипотеза

Първо изследване.След като през 1902 г. Garrod посочи връзката на генетичен дефект в алкаптонурията с неспособността на организма да разгражда хомогентизинова киселина, е важно да се изясни специфичният механизъм, лежащ в основата на това заболяване. Тъй като тогава вече беше известно, че метаболитните реакции се катализират от ензими, може да се предположи, че нарушението на някакъв ензим води до алкаптонурия. Такава хипотеза е дискутирана от Дриш (през 1896 г.). То също е изразено от Haldane (1920, виж) и Garrod (1923). Важни етапи в развитието на биохимичната генетика са работата на Кун и Бутенанд върху изследването на цвета на очите при мелничарския молец. Ephesia kuhniellaи подобни изследвания на Beadle и Ephrussi on дрозофила(1936). В тези пионерски произведения мутанти на насекоми, изследвани преди това чрез генетични методи, бяха избрани, за да се изяснят механизмите на действие на гените. Този подход обаче не доведе до успех. Проблемът се оказа твърде сложен и за да го разреши, беше необходимо:

1) изберете прост модел организъм, удобен за експериментално изследване;

2) да се търси генетичната основа на биохимичните белези, а не биохимичната основа на генетично детерминираните черти. И двете условия са изпълнени от Beadle и Tatum през 1941 г. (вижте също Beadle 1945).

Модел на Beadle и Tatum. Статията им започва така:

„От гледна точка на физиологичната генетика, развитието и функционирането на един организъм може да се сведе до сложна система от химични реакции, които по някакъв начин се контролират от гените. Съвсем логично е да се предположи, че тези гени... или сами действат като ензими, или определят тяхната специфичност. Известно е, че генетичните физиолози обикновено се опитват да изследват физиологичните и биохимичните основи на вече известни наследствени черти. Този подход позволи да се установи, че много биохимични реакции се контролират от специфични гени. Такива проучвания показват, че ензимите и гените имат еднакъв ред на специфичност. Въпреки това, обхватът на този подход е ограничен. Най-сериозното ограничение е, че в този случай в полезрението на изследователите попадат наследствени черти, които нямат смъртоносен ефект и следователно са свързани с реакции, които не са много важни за живота на организма. Втората трудност... е, че традиционният подход към проблема включва използването на външно проявени знаци. Много от тях са морфологични вариации, базирани на системи от биохимични реакции, толкова сложни, че анализът им е изключително труден.

Тези съображения ни доведоха до следното заключение. Изследването на общия проблем на генетичния контрол на биохимичните реакции, които определят развитието и метаболизма, трябва да се извърши с помощта процедура, противоположна на общоприетата:вместо да се опитваме да открием химическата основа на известните наследствени белези, е необходимо да се установи дали гените контролират известни биохимични реакции и как го правят.Невроспората на аскомицета има свойствата, които позволяват прилагането на този подход и в същото време служи като удобен обект за генетични изследвания. Ето защо нашата програма е изградена върху използването на този конкретен организъм. Изхождахме от факта, че облъчването с рентгенови лъчи причинява мутации в гените, които контролират определени химични реакции. Да предположим, че за да оцелее в дадена среда, организмът трябва да извърши някакъв вид химическа реакция, то мутантът, лишен от тази способност, при тези условия ще бъде нежизнеспособен. Въпреки това, той може да бъде поддържан и изследван, ако се отглежда в среда, към която е добавен жизненоважният продукт на генетично блокирана реакция."

4 Действие на гените 9

Ориз. 4.1. Схема на експеримента за откриване на биохимични невроспорови мутанти В пълна среда мутациите, предизвикани от рентгенови лъчи или ултравиолетови лъчи, не пречат на растежа на гъбичките. Въпреки това, мутантът не расте на минимална среда. Когато витамините се добавят към минималната среда, способността за растеж се възстановява. Когато се добавят аминокиселини, няма растеж Въз основа на тези данни може да се предположи, че мутацията е възникнала в гена, който контролира метаболизма на витамина. стъпка е да се идентифицира витаминът, който може да възстанови нормалната функция. Генетичният блок е открит сред реакциите на витамин биосинтеза.

След това Beadle и Tatum описват дизайна на експеримента (Фигура 4.1). Съставът на пълната среда включва агар, неорганични соли, екстракт от малц, екстракт от дрожди и глюкоза. Минималната среда съдържаше само агар, соли, биотин и източник на въглерод. Мутантите, които растат върху пълната среда и не растат на минималната среда, са изследвани най-подробно. За да се установи съединението, чийто синтез е нарушен във всеки от мутантите, към минималния агар се добавят отделни компоненти на пълната среда.

По този начин са изолирани щамове, които не са в състояние да синтезират определени растежни фактори: пиридоксин, тиамин и парааминобензоена киселина. Доказано е, че тези дефекти се дължат на мутации в специфични локуси. Работата поставя началото на множество изследвания върху невроспори, бактерии и дрожди, в които се установява съответствие между „генетичните блокове“, отговорни за отделните метаболитни стъпки и специфичните ензимни нарушения. Този подход бързо се превърна в инструмент за изследователите за разкриване на метаболитни пътища.

Хипотезата "един ген - един ензим" получи силно експериментално потвърждение. Както показа работата през следващите десетилетия, тя се оказа изненадващо плодотворна. Анализът на дефектните ензими и техните нормални варианти скоро направи възможно идентифицирането на клас генетични нарушения, които доведоха до промяна във функцията на ензима, въпреки че самият протеин все още се открива и запазва имунологични свойства. В други случаи температурният оптимум на ензимната активност се променя. Някои варианти могат да се обяснят с мутация, която засяга общия регулаторен механизъм и в резултат на това променя активността на цяла група ензими. Такива изследвания доведоха до създаването на концепцията за регулиране на генната активност в бактериите, която включва концепцията за оперона.

10 4. Действие на гените

Първите примери за ензимни нарушения при хора.Първото човешко наследствено заболяване, за което може да бъде показано ензимно разстройство, е метхемоглобинемия с рецесивен начин на унаследяване (Gibson and Harrison, 1947; Gibson, 1948) (25080). В този случай увреденият ензим е NADH - зависима метхемоглобин редуктаза. Първият опит за систематично изследване на група човешки заболявания, свързани с метаболитни дефекти, е направен през 1951 г. В проучване на болестта на натрупването на гликоген, Corys показа, че в осем от десет случая на патологично състояние, което е диагностицирано като болест на Gierke (23220), структурата на чернодробния гликоген е нормален вариант, а в два случая е явно нарушена . Беше също така очевидно, че чернодробният гликоген, натрупващ се в излишък, не може да бъде директно превърнат в захар, тъй като пациентите са склонни към хипогликемия. Много ензими са необходими за разграждането на гликогена до глюкоза в черния дроб. Два от тях, амил-1,6-глюкозидаза и глюкозо-6-фосфатаза, бяха избрани за изследване като възможни дефектни елементи на ензимната система. В черния дроб хомогенати при различни стойностиИзмерва се рН за освобождаване на фосфат от глюкозо-6фосфат. Резултатите са представени на фиг. 4.2. В нормален черен дроб е установена висока активност с оптимум при pH 6-7. Тежката чернодробна дисфункция при цироза корелира с леко намаляване на активността. От друга страна, в случай на болестта на Gierke с фатален изход, активността на ензима изобщо не може да бъде открита; същият резултат е получен при прегледа на втория подобен пациент. При двама пациенти с по-леки симптоми се наблюдава значително намаляване на активността.

Направено е заключение, че в тези случаи на болестта на Gierke с фатален изход е имало дефект в глюкозо-6-фосфатазата. В повечето по-леки случаи обаче активността на този ензим не е по-ниска от тази при чернодробна цироза и само при двама пациенти е малко по-ниска (фиг. 4.2).

Според съпрузите Кори ненормалното натрупване на гликоген в мускулната тъкан не може да бъде свързано с липса на глюкозо-6-фосфатаза, тъй като този ензим липсва в мускулите и е нормален. Като възможно обяснение на мускулната гликогеноза те предполагат нарушение на активността на амило-1,6-глюкозидазата. Тази прогноза скоро се потвърди: Forbes открива такъв дефект в един от клинично значимите случаи на заболяване на натрупването на гликоген, включващо сърцето и скелетните мускули. Сега ние

4. Действие на гените 11

голям брой ензимни дефекти са известни при болестта на съхранение на гликоген.

Въпреки че степента на проявление различни формина това заболяване са малко различни, клинично има много общо между тях. С едно изключение, всички те се унаследяват по автозомно рецесивен начин. Ако ензимните дефекти не бяха открити, патологията на натрупването на гликоген би се разглеждала като едно заболяване с характерни вътрешносемейни корелации в тежестта, подробностите на симптомите и времето на смъртта. По този начин имаме пример, при който генетичната хетерогенност, която може да се предположи само въз основа на изследването на фенотипа (раздел 3.3.5), беше потвърдена чрез анализ на биохимично ниво: изследването на ензимната активност направи възможно идентифицирането специфични гени.

През следващите години темпът на изследване на ензимните дефекти се увеличава и за 588 идентифицирани рецесивни автозомни гена, които МакКусик описва в шестото издание на книгата си Mendelian Inheritance in Man (1983), повече от 170 случая са открити със специфични ензимни нарушения. . Нашият напредък в тази област е пряко свързан с развитието на концепциите и методите на молекулярната генетика.

Някои етапи от изследването на ензимните нарушения при хората.Представяме само най-важните етапи в този непрекъснат процес: 1934 г. Фьолинг открива фенилкетонурия

1941 Бийдъл и Тейтъм формулират хипотезата за един ген-един ензим 1948 Гибсън описва първия случай на ензимно разстройство при човешко заболяване (рецесивна метхемоглобинемия)

1952 Кори открива дефицит на глюкоза-6-фосфатаза при болестта на Gierke

1953 Jervis демонстрира отсъствието на фенилаланин хидроксилаза при фенилкетонурия. Бикел съобщава за първия опит за облекчаване на ензимно разстройство чрез приемане на диета с ниско съдържание на фенилаланин.

1955 Smithies разработва техниката за електрофореза с нишестен гел

1956 Carson et al. откриват дефект в глюкозо-6-фосфат дехидрогеназата (G6PD) в случай на индуцирана хемолитична анемия

1957 Калкар и др. описват ензимен дефицит при галактоземия, показвайки, че хората и бактериите имат идентично ензимно разстройство

1961 Крут и Вайнберг демонстрират ензимен дефект при галактоземия in vitro в култивирани фибробласти

1967 Sigmiller et al. откриват дефект на хипоксантин-гуанин фосфорибозилтрансфераза (HPRT) в синдрома на Lesch-Nyhan

1968 Cleaver описва нарушение на ексцизионното възстановяване при xeroderma pigmentosa

1970 Нойфелд идентифицира ензимни дефекти в мукополизахариди, което прави възможно идентифицирането на пътищата за разграждане на мукополизахаридите

1974 Браун и Голдщайн доказаха, че генетично обусловеното свръхпроизводство на хидроксиметилглутарил-КоА редуктаза при фамилна хиперхолестеролемия се дължи на дефект в разположения в мембраната липопротеинов рецептор с ниска плътност, който модулира активността на този ензим (HMG)

1977 Sly et al., демонстрира, че маноза-6-фосфат (като компонент на лизозомните ензими) се разпознава от фибробластните рецептори. Генетичен дефект в обработката предотвратява свързването на лизозомни ензими, което води до нарушено освобождаване в цитоплазмата и последваща секреция в плазмата (I-клетъчно заболяване)

12 4. Действие на гените

1980 При псевдохипопаратиреоидизъм е открит дефект в протеина, който осигурява свързването на рецептора и циклазата.