A távhibridizáció során olyan izolált szövettenyésztési módszereket alkalmaznak, mint az in vitro megtermékenyítés, az embriótenyésztés (izolált embriók termesztése mesterséges táptalajokon), az értékes hibridek klonális mikroszaporítása, valamint az in vitro haploid termelés és a mélyhűtés.

In vitro megtermékenyítés (a programok inkompatibilitásának leküzdése) abban az esetben végezzük, ha a kiválasztott párok közötti megtermékenyítés természetes körülmények között nem lehetséges. Ennek több oka lehet: 1) fiziológiai (a pollenérés idejében mutatkozó eltérés stb.); 2) morfológiai (rövid pollencső vagy növekedésének blokkolása a fejlődés különböző szakaszaiban stb.). Az in vitro megtermékenyítés kétféleképpen történhet: a) a petefészek mesterséges agar táptalajon történő tenyésztése kész virágporral; b) a petefészket kinyitják, és a méhlepény ovális darabjait a tápközegbe juttatják, amelynek közelében vagy közvetlenül a méhlepény szövetein kész virágport tenyésztenek. A petesejtek méretének gyors növelésével vizuálisan megállapítható, hogy az in vitro megtermékenyítés elmúlt-e vagy sem. A kialakult embrió általában nem megy nyugalmi állapotba, hanem azonnal kicsírázik, és hibrid generációt hoz létre. Az in vitro méhlepény-megtermékenyítés lehetővé tette a N. tabacum termesztett dohányfajták és a vadon élő N. rosulata és N. debneyi fajok keresztezésének inkompatibilitását, és lehetővé tette interspecifikus dohányhibridek előállítását MF Ternovsky és munkatársai kísérletei során. 1976), Shinkareva (1986).

A posztgám összeférhetetlenség leküzdése. A posztgám inkompatibilitás a távoli hibridizációval a megtermékenyítés után következik be. Ez gyakran apró, nem csírázó magvak képződését eredményezi. Az ok az embrió és az endospermium fejlődési idejének eltérése lehet. Az endospermium gyenge fejlődése miatt az embrió nem tud normálisan csírázni. Ilyen esetekben az embriót egy érett, vékony szemből izolálják, és tápközegben növesztik.

Az embriók mesterséges tápközegben történő termesztését embriótenyészetnek nevezzük. Az érett embrió termesztésére szolgáló tápközeg lehet egyszerű, fiziológiailag aktív anyagok (például White táptalaj) vagy bármely más ásványi sókat és szacharózt tartalmazó táptalaj nélkül. Távolabbi keresztezéseknél már a korai stádiumban megfigyelhetők az embrió fejlődési zavarai, ami differenciálódás hiányában, lassú növekedésben nyilvánul meg. Ebben az esetben az embrió tenyésztése két szakaszból áll - az embrió embrionális növekedéséből, amely során a differenciálódás folytatódik, és a kifejlett embrió csírázásából. Az első szakaszhoz összetettebb közeg szükséges magas tartalom szacharóz, különféle aminosavak, vitaminok és hormonok adalékaival.

Az embriókultúra tenyésztési felhasználása elsajátítja Utóbbi időben nagy jelentőséggel bír a gabonafélék, gabonafélék és más mezőgazdasági termények távoli hibridjeinek előállításában. Bemutatjuk a búza-rozs hibridek terméshozamának növelésének lehetőségét éretlen embriók termesztésével, valamint az embriókultúra alkalmazását a búza rostélyos hibridizációjában a poszt-gamusz inkompatibilitás kiküszöbölésére.

Az embriótenyésztés módszerét egyre gyakrabban alkalmazzák a zöldségnövények interspecifikus hibridizációjában. A hagyma esetében technikákat fejlesztettek ki az embriogenezis különböző szakaszaiból származó hibrid magokból in vitro abortív embriók, részben termékeny interspecifikus hibridekből történő embriók termesztésére. Az izolált embriók tenyészetét paradicsom és más zöldségnövények nemesítésében használják.

Vizsgálták a paradicsomembriók növekedésének és fejlődésének hormonális szabályozását in vitro. Megtárgyalják az embriókultúra felhasználásának lehetőségét távoli napraforgóhibridek előállítására, tanulmányozzák az in vitro beporzást követően különböző időpontokban izolált napraforgóembriók növekedését és fejlődését szabályozó tényezőket.

Az izolált embriók tenyésztését a távoli hibridizáció segédmódszereként nemcsak a posztgám inkompatibilitás leküzdésére, hanem az értékes hibridek mikroszaporítására is használják. Ebben az esetben a mikroszaporítás kalluszogenezissel, morfogenezis indukálásával és regenerált növények termelésével kalluszszövetből megy végbe. Az éretlen embriók klónozásának technikája lehetővé teszi értékes növényi genotípusok korai stádiumban történő szaporítását életciklus. Az embriók tenyésztésének másik lehetősége a sejtszelekcióban való felhasználása.

Távoli hibridek klonális mikroszaporítása. Az embriokultúra lehetővé teszi hibrid növények termesztését hibás embriókból. A hibrid növények termése azonban alacsony, a hibridek gyakran sterilek. Néha például a hajdina nemesítésekor a termés keresztbeporzása miatt nehéz egyedi genotípusokat reprodukálni az utódokban. Ezért a kutatók gyakran szembesülnek azzal a feladattal, hogy a keletkezett növényeket szaporítsák és konzerválják. Ebben segít a klonális mikroszaporítás módszere. A hibridek szaporítása a hónaljrügy-merisztéma fejlődésének aktiválásával (steril hajtások kivágásával), járulékos rügyekkel vagy a növények kalluszszövetből történő regenerálásával, különösen embriók tenyésztésével nyerhető.

Haploidok in vitro kinyerése és tenyésztésben való felhasználása. A haploid növények nemesítésben betöltött szerepe nagyon nagy. Használatuk lehetővé teszi a megfelelő kombináció gyors megtalálását, csökkenti a fajta létrehozásának idejét. Haploidokat használnak a stabil homozigóta vonalak előállítására. A mutagenezishez kényelmesebb a haploidok alkalmazása is, mivel a recesszív mutációk kiválasztása haploid szinten történik.

A diploid növényekben a mutációk ritkán érintik a homológ kromoszómák mindkét allélgénjét. Az egyed általában heterozigóta (két gén különbözik), és csak a domináns (de nem recesszív) gén érintett. Mivel a mutációk gyakrabban recesszívek, mint dominánsak, meglehetősen nehéz azonosítani őket. A haploid növényekben, amelyek minden homológ kromoszómapárból csak egyet tartalmaznak, azonnal megjelennek a mutációk. A haploid szintű szelekció nemcsak a domináns, hanem a recesszív tulajdonságok közvetlen szelekcióját is lehetővé teszi.

A haploid egyedek sterilek, de lehetséges a kromoszómakészletüket mesterségesen megkétszerezni kolchicinnel, és diploid homozigóta növényeket nyerni.

A haploidok spontán módon keletkezhetnek, de spontán előfordulásuk gyakorisága nagyon alacsony. Mesterségesen, in vitro módszerekkel nagyszámú haploid növény nyerhető. Háromféleképpen lehet haploidokat nyerni az izolált szövettenyésztési módszerrel:

androgenezis - haploid növények kinyerése mesterséges táptalajon izolált portokokból és mikrospórákból.

gynogenezis - haploid növények kinyerése mesterséges táptalajon izolált petesejtekből;

partenogenezis - haploidok kinyerése hibrid embrióból, amelyben a szülők kromoszómáinak összeférhetetlensége miatt az apai kromoszómák elvesznek.

Az apai genom kromoszómáinak eliminációja eredményeként kialakult haploid embriókat mesterséges táptalajokon tenyésztik, és haploid növényeket nyernek. Az Istok és Odessa-15 árpafajtákat a partenogenetikai módszer és az izolált embriók tenyésztésével kombinálva a szokásos 10-12 év helyett négy év alatt állították elő. Több mint 2,5 ezer, homogenitással és stabilitással jellemezhető dihaploid vonalat hoztak létre portokkultúra módszerével lágy és durumbúza fajtáiból és hibridjeiből az Elita Povolzhya NPO-ban négy éve.

Folytatódik a haploidok búza, árpa, kukorica, őszi rozs és burgonya portokkultúrájával történő előállításának technológiája. A portokkultúrában a haploid növények kialakulásának két módja lehetséges. Az első a növények kialakulása embriogenezis útján a pollenszemekben. Ugyanakkor a portok belsejében lévő egyes pollenszemekből embrioidok keletkeznek. Csíráznak és haploid növényeket hoznak létre. A második a kallusz kialakulása a portoksejtekből. Ezt követően a morfogenezis eredményeként a növények regenerálódnak a kalluszsejtekből. Ebben az esetben a kapott növények nem mindig haploidok, és gyakran különböznek egymástól. Nem teljesen világos, hogy poliploidizált haploid sejtekből vagy fuzionált sejtekből jönnek-e létre.

Az in vitro nyert haploidok nemcsak gyakorlati szelekcióban, hanem géntechnológiában és sejtszelekcióban is alkalmazhatók. A pollenszemek bizonyos esetekben kényelmesebb tárgyak, mint a protoplasztok a genetikai transzformációval kapcsolatos kísérletekhez.

Növények mélyhűtése

A növényi szomatikus sejtek folyékony nitrogénben történő mélyhűtése (hőmérséklet - 196°C) a biotechnológia új iránya, amelyet az 1970-es évek eleje óta széles körben fejlesztettek ki. Ennek a technológiának az a célja, hogy megőrizze a génállományt in vitro tenyészetben, valamint hogy a tenyésztők bármikor olyan genotípust biztosítsanak, amely rendelkezik a kívánt tulajdonságokkal: a hibridizációhoz szükséges pollen; egyedi és egyedi magvak, beleértve azokat is, amelyek nem bírják a kiszáradást; különböző növényfajok transzformált, mutáns, hibrid sejtjei, amelyek képesek in vitro morfogenezisre; zigóta és szomatikus embriók stb. Jelenleg több mint 30 faj tenyésztett sejtjére, kalluszkultúrákra (kb. 10 faj), izolált protoplasztokra (8 faj), merisztémák (25 faj) és szárcsúcsokra (13 faj) dolgoztak ki mélyhűtési feltételeket. Ebben az irányban a prioritás az Orosz Tudományos Akadémia Növényfiziológiai Intézetét és különösen a Prof. R. G. Butenko.

A mélyhűtéssel kapcsolatos munkák során mindenekelőtt figyelembe kell venni a növényi sejtek sajátosságait: kis vakuólumú és alacsony víztartalmú kis sejteket kell kiválasztani; a növényi sejtek fagyasztására és utólagos felolvasztására vonatkozó megközelítések kidolgozása minden egyes esetben. A mélyhűtés során számos nehézséggel kell szembesülni, amelyek közül az egyik a fagyott sejtek és szövetek ozmotikus stressztől való védelméhez, valamint a sejten belüli jégkristályok képződése és növekedése következtében fellépő szerkezetek mechanikai roncsolásához kapcsolódik. Ugyanakkor helyesen kell kiválasztani azokat a körülményeket, amelyek biztosítják a sejtek magas túlélését a felolvasztás és a regenerálás során.

Az ilyen irányú munkák sokfélesége ellenére mégis felvázolták a mélyhűtés alapjául szolgáló gyakori technikákat: a sejtek fagyasztás előtti kezelését, krioprotektánsok használatát, bizonyos fagyasztási rend betartását 0 és –40°C között (ritka esetekben akár -70°C). C), valamint a tárgyak felolvasztására vonatkozó különleges óvintézkedéseket.

A mélyhűtési folyamat általában a sejttenyészet fagyasztásra való előkészítésével kezdődik. Ezt többféleképpen lehet elérni, a sejtek tenyésztésével különböző ozmotikusan aktív anyagokat tartalmazó táptalajokon: mannit vagy szorbit 2-6%-os koncentrációban, aminosavak, és ezek közül is elsősorban a prolin A növényi sejtekben a vízmegkötés széles körben ismert, csakúgy, mint az y-aminovajsav.

Az ozmotikus és mechanikai stressz okozta sejtkárosodást csökkentő krioprotektánsok kiválasztása empirikusan történik a legkisebb toxicitás és az optimális hatás elve szerint. Az összes ismert fagyvédő szerek között vannak olyan anyagok, amelyek könnyen behatolnak a sejtekbe, mint például a dimetil-szulfoxid (DMSO, 5-10%), a glicerin (10-20%), valamint a nem áthatoló, nagy molekulatömegű polivinil-pirrolidon (PVP), dextrán, polietilénglikol (PEG), molekulatömege 6000.

A mélyhűtésben nagy jelentősége van a helyesen kiválasztott fagyasztási módnak 0 és –40 °C között. Általános szabály, hogy minden tárgy esetében 0,5–1 °C/perc fagyasztási sebesség van beállítva, és ezt a munkát speciális berendezéseken végzik. amely a szoftver lefagyását biztosítja. Az ilyen eszközöket a Kriobiológiai és Kriomedicinai Problémaintézetben (Kharkov) egy speciális tervezési technológiai iroda állítja elő, kísérleti gyártással.

Így a lassú fagyasztás és a krioprotektánsok alkalmazása lehetővé teszi a sejt felszabadítását a szabad víztől, és –40°C-on a sejtek teljesen kiszáradnak, ami lehetővé teszi a további fagyasztás elvégzését, vagyis az ampullák növényi anyaggal való bemerítését. folyékony nitrogénben.

Az anyag folyékony nitrogénben való tárolása gyakorlatilag korlátlan. Például az Orosz Tudományos Akadémia Növényélettani Intézetének kriobankjában a sárgarépa sejteket folyékony nitrogénben körülbelül 20 évig, a burgonya merisztémákat több mint 10 évig tárolják stb.

A folyékony nitrogénben történő tárolás után a sejtek életképességének felolvasztása és tesztelése a mélyhűtési technológia utolsó lépése. Ha a fagyasztást lassan, fokozatosan végezzük, akkor a felengedést a lehető leggyorsabban kell elvégezni. Ehhez az ampullákat 40 ° C-os, néha 60 ° C-os vízfürdőbe helyezzük, és addig tartjuk, amíg az utolsó jégkristály teljesen el nem tűnik.

A sejtek felolvasztás utáni életképességének meghatározására a legegyszerűbb, leggyorsabb és meglehetősen kielégítő módszert alkalmazzák - létfontosságú festékkel (0,1% fenoszafranin vagy 0,25% Evans-kék oldat) történő festés, amelynek eredményeként az elhalt sejtek megfestődnek, de az élők. ők nem. A végső kritérium természetesen a sejtnövekedés és -osztódás egyértelmű újraindulása a kiolvasztás után mesterséges tápközegen végzett rekultiváció során.

Kísérletileg kimutatták, hogy a folyékony nitrogénben történő tárolás után a sejtek nem veszítik el osztódási, növényi regenerációs képességüket, nem csökken a másodlagos metabolitok (termelő sejtek) szintézisének termelékenysége stb. Így az Orosz Tudományos Akadémia Növényfiziológiai Intézete a burgonyatermesztésért felelős NPO-val közösen módszereket dolgozott ki négy burgonyafajta merisztémájának mélyhűtésére, és megmutatta annak lehetőségét, hogy a tárolt merisztémák 20%-ából egész növényeket regeneráljunk. szántóföldre ültetve nem különbözött minden tulajdonságában, beleértve a növekedési sebességet és a termelékenységet is, a közönséges kémcsöves növényektől (S. Manzhulin et al., 1982). A mélyhűtés technikájáról további részletek találhatók A. S. Popov áttekintő dokumentumaiban.

Így a növényi tárgyak mélyhűtésével kapcsolatos technológia fejlődik és folyamatosan javul. Ennek a technológiának kétségtelenül megvan a maga jövője, hiszen a kriobankok még ma is nagyban megkönnyíthetik a nemesítők munkáját, lehetőséget adva számukra a fajta génállományának széles körben történő felhasználására, beleértve a régi szelekciót és a vadon élő fajokat, valamint a veszélyeztetett növényfajokat.



V. V. Rogovaja, M. A. Gvozdev

A KŐTERMÉNYEK MIKROKLONÁLIS SZAPORODÁSÁNAK JELLEMZŐI IN VITRO KÖRÜLMÉNYEK KÖZÖTT

A cikk áttekintést ad a csonthéjasok mikroszaporítási módszereinek jellemzőiről gyümölcsnövények in vitro rendszerben. Különös figyelmet fordítanak a hónaljrügyekkel történő szaporításra, valamint a cseresznye, cseresznye, őszibarack és sárgabarack levélexplantátumaiból származó járulékos hajtások regenerálására. Szóba kerül a növények különféle kórokozóktól való gyógyítása, valamint a csonthéjasok növényi anyagának vírusfertőzések jelenlétének vizsgálata.

Először Georges Morel francia tudós végzett mikroszaporítást orchideákon a huszadik század 50-es éveiben. Munkáiban a növények csúcsi merisztémája művelésének technikáját alkalmazta. Az így kapott növények vírusfertőzéstől mentesek voltak.

Hazánkban a Növényélettani Intézetben a 60-as években kezdődtek meg a növények merisztéma módszerrel és klonális mikroszaporítással történő javításával kapcsolatos kutatások. K. A. Timiryazev, a Szovjetunió Tudományos Akadémia.

Mikroklonális szaporítás - olyan in vitro növények előállítása, amelyek genetikailag azonosak az eredeti explantátummal (a növények vegetatív szaporításának módszere in vitro tenyészetben). A mikroszaporítás a szomatikus növényi sejt egyedülálló tulajdonságán – a totipotencián – alapszik – a sejtek azon képességén, hogy teljes mértékben ki tudják használni az egész szervezet genetikai potenciálját.

Jelenleg egyre fontosabbá válnak a mezőgazdasági (elsősorban vegetatívan szaporított) mezőgazdasági növények mikroklonális szaporításának különféle módszerei az in vitro rendszerben: szaporodás hónalj és járulékos rügyekkel, indirekt morfogenezis, szomatikus embriogenezis.

Ezen módszerek használata lehetővé teszi:

A kiválasztási folyamat felgyorsítása, melynek eredményeként a piacképes termékek megszerzésének határideje 10-12 év helyett 2-3 évre csökken;

Rövid időn belül nagy mennyiségű egészséges, vírusmentes, az anyanövénnyel genetikailag azonos anyagot kapni;

Laboratóriumi körülmények között dolgozzon, és egész évben támogassa az aktívan növekvő növényeket;

A növények szaporítása gyakorlatilag a külső környezettel való érintkezés nélkül, ami kiküszöböli a káros abiotikus és biotikus tényezők hatását;

Szerezze meg a maximális számú növényt területegységenként;

Rövid időn belül nagyszámú, nehezen szaporítható vagy vegetatívan nem szaporítható növény beszerzése;

Hosszú juvenilis fázisú növények termesztése esetén felgyorsítható az átmenet a fiatalkoriból a szaporodási szakaszba;

Hosszú ideig (1-3 éven belül), hogy a növényi anyagot in vitro körülmények között tartsák (friss táptalajon való áthaladás nélkül),

Bankok létrehozása a növények értékes formáinak és egyes szerveiknek hosszú távú tárolására;

Módszerek kidolgozása in vitro fertőtlenített anyagok mélyhűtésére.

A csonthéjas gyümölcsök mikroszaporításának szakaszai és a vírusfertőzések jelenlétének vizsgálata

A mikroszaporítás folyamata több szakaszból áll. A főbbek a következők:

1. szakasz - az explantátum bejuttatása a tenyészetbe in vitro;

2. szakasz - mikroszaporítás;

3. szakasz - a mikrohajtások gyökeresedésének folyamata;

4. szakasz - a gyökeres növények kilépése steril körülményekről nem sterilre.

A növények in vitro mikroszaporításának fontos lépése a növények vírusmentes anyaformáinak termesztése termesztőházakban vagy téli üvegházakban elkülönített dobozokban, vírusvektorok számára hozzáférhetetlen körülmények között. Az in vitro tenyészetbe történő későbbi bejuttatáshoz az explantátum donor növényeket vírusos, mikoplazmás és bakteriális fertőzések jelenlétére kell vizsgálni PCR diagnosztikai módszerekkel, akár molekuláris hibridizációval, akár enzim immunoassay-vel (ELISA).

Az ELISA módszer lehetővé teszi a csonthéjas termést fertőző vírusok túlnyomó többségének rövid időn belüli kimutatását: a szilvatörpe vírus, a csonthéjas gyümölcsök nekrotikus gyűrűfoltos vírusa, a szilva cápa potyvírus, a cseresznyelevél göndörödésének nem povírusai. Az ELISA-val kontaktvírusoktól mentesnek talált klónokat ezután alapvizsgálatnak vetik alá, amely szerológiai teszteket és indikátornövényeken végzett tesztet tartalmaz. A vírusoktól és egyéb szabályozott kórokozóktól mentesnek talált növényeket a vizsgálatok eredménye szerint a "vírusmentes" alapklónok kategóriába sorolják. Ha fertőzést észlelnek, az eredeti növények rehabilitálhatók. A csonthéjas növények vírusoktól való helyreállításához a legcélravezetőbb a szárazlevegős hőterápia és az in vitro tenyésztés módszereinek kombinálása. Ha az izolált apikális merisztémák tenyészetében nem sikerül megszabadulni a vizsgált vírusoktól, kemoterápiás módszereket alkalmaznak, amelyek olyan vegyszerek tápközegbe juttatásán alapulnak, amelyek gátolják a vírusfertőzés kialakulását a növényekben in vitro.

Néha a bakteriális mikroflóra aktív azonosítása érdekében a tápközeget különféle szerves adalékokkal, például kazein-hidrolizátummal dúsítják, amely szaprofita mikroorganizmusok fejlődését provokálja. A fertőzést 7-10 nap elteltével vizuálisan értékeljük. A "tiszta" explantátumokat táptalajra helyezzük további tenyésztés céljából. Gyakorold ebben a szakaszban és a növekedési anyagoktól mentes környezet használatát.

A csonthéjasok in vitro tenyésztésének és mikroszaporításának bemutatása

A gyümölcsös csonthéjas növények klonális mikroszaporítása során általában az apikális és oldalrügyeket, valamint a merisztémás csúcsokat használják explantátumforrásként. Az apikális merisztéma izolálását általánosan elfogadott módszerek szerint végezzük a növényi anyag fokozatos sterilizálása után.

Csonthéjas növények mikroszaporításához különféle táptalajokat használnak: cseresznye mikroszaporítására - Pierik, Gautre, White, Heller táptalajok, cseresznyéhez és szilvához - Rosenberg-féle gyümölcsnövényekhez és szilvához módosított táptalajok - Lepoyvre és B5 táptalajok. A cseresznye, cseresznye és szilva mikroszaporítására azonban a Murashige-Skoog (MS) táptalaj a legalkalmasabb.

A csonthéjas gyümölcsök mikroklonális szaporítási stádiumától függően 0,2-2 mg/l koncentrációban 6-benzilaminopurint (6-BAP) adnak a táptalajokhoz. Az in vitro tenyészetbe való bejuttatás szakaszában a citokinint alacsonyabb koncentrációban használjuk - 0,2 mg/l BAP-t. A hónaljrügyek elszaporodásának indukálására a maximális hajtásszám elérése érdekében a cseresznye mikronövényeket BAP hozzáadásával 0,5-2 mg/l, a szilva mikronövényeket 0,5-1 mg/l BAP koncentrációban neveljük.

A mikrohajtások gyökeresedésének folyamata

A gyökeresedés szakasza különös figyelmet igényel. A csonthéjas növények in vitro hajtásainak gyökeresedésének folyamata a fajtajellemzőktől, az elvégzett passzázsok számától, az auxin koncentrációjától és típusától, valamint alkalmazásának módjától függ. A csonthéjas növények teljesen kialakult mikronövényeinek előállításához a rizogenezis folyamatait megakadályozó 6-BAP-t kizárják a táptalajból, és auxinokat, elsősorban β-indolil-3-vajsavat (IMA) juttatnak a táptalajba. Megállapítást nyert, hogy az IMC optimális koncentrációja a táptalaj összetételében 0,5-1 mg/l tartományban van. Az IMC jelenléte a táptalajban 2 mg/l koncentrációban hipertrófiás gyökerek kialakulását okozza.

A ribav készítmény (1 ml/l) és a hagyományos fitohormon auxinok [IMA és β-indolecetsav (IAA) egyenként 0,5 mg/l] együttes bevitele a gyökerező táptalajba számos kőfajtánál megnöveli a hajtás gyökeresedésének százalékos arányát. gyümölcsnövények.

A gyökérképződést indukáló szerek: IAA, IAA és α-naftil-ecetsav (NAA) összehasonlító vizsgálata során az IAA magas hatékonyságát mutatták ki 6,0 mg/l koncentrációban. A legtöbb gyökeres cseresznye mikrodugványt NAA-t tartalmazó táptalajon kaptuk. Ugyanakkor a hajtások alapterületén intenzív kallusznövekedés következett be, ami megnehezítette a gyökeres kémcsöves növények nem steril körülményekbe való átvitelét.

A csonthéjasok kémcsöves növényeinek hatékony gyökeresedéséhez nemcsak a stimuláns típusa, hanem az alkalmazásának módja is nagy jelentőséggel bír. A rizogenezis indukálására az auxinok tápközegbe juttatása mellett a hajtások előzetes áztatása steril vizes IBA (25-30) mg/l 12-24 órás expozíció mellett történik. Az elvégzett kísérletek azt mutatták, hogy a mikrometszetek kezelése IBA vizes oldatával hatékonyabb, mint ennek a szabályozónak a táptalajba való bejuttatása. Az első járulékos gyökerek tömeges megjelenését rizogenezis-induktorral végzett előkezeléssel a 20-25. napon észleltük. A rizogenezis kiváltásának másik módja a csonthéjas termések hajtásainak kezelése 0,125%, 0,25% koncentrációjú talkum-auxint tartalmazó IMC-porral és 0,25%, 0,5% IAA-val. Hormonális por alkalmazásakor megfigyelték a rizogenezis induktorok alkalmazásának nagy hatékonyságát és gyárthatóságát. De a különböző koncentrációjú auxint tartalmazó IMC talkum fajtaspecifikusságot mutatott ki a szilva mikrodugványok gyökereztetésében.

A rizogenezis folyamata legintenzívebben módosított MS és White táptalajokon megy végbe. Más források szerint a legjobb táptalaj a gyökérképződéshez a Heller makrotáptalajok hozzáadott vitaminokkal és félig hígított MS táptalaj csökkentett, 15 mg/l-es szacharóztartalommal és a mezoinozitol kivételével, amely elősegíti a kalluszszövet képződését. A legtöbb munkában azonban a Murashige és Skoog táptalajt használják csonthéjas gyümölcsök mikrohajtásainak gyökerezésére.

Mikroszaporítási módszerek

Számos módja van a növények in vitro mikroszaporításának:

Szaporodási módszerek hónaljrügyekkel;

A járulékos rügyek általi szaporítás módjai;

Közvetett morfogenezis;

szomatikus embriogenezis.

Bármilyen típusú in vitro regeneráció esetén négy tényezőcsoport különíthető el, amelyek meghatározzák annak sikerességét: az eredeti szülőnövény genotípusa és állapota; a termesztés feltételei és módjai; tápközeg összetétele; az explantátum steril tenyészetbe való bejuttatásának jellemzői.

A genotípus hatása a mikroszaporítás hatékonyságára

A mikroszaporítás hatékonyságát leginkább a genotípus befolyásolja. A növényeknek az aszeptikus termesztés körülményeire való reakciója a fajtajellemzőktől függ, és a gyümölcs- és bogyós növények fajtáinak eltérő regenerációs képességével magyarázható. Például, amikor a klonális mikroszaporítást új cseresznyefajták gyors szaporítására alkalmazzák, a fajtajellemzők a domináns tényezők a növények mikroszaporodási képességében.

A fajtakülönbségek mind a szaporodás, mind a gyökérképződés szakaszában megmutatkoztak.

Ugyanazon gyümölcsös növényfajok különböző fajtáinak explantátumai között gyakran eltérő mértékben nyilvánul meg a táptalajban lévő növekedésszabályozókkal szembeni reakció, ami bizonyos mértékig nyilvánvalóan tükrözi a növekedési anyagok endogén tartalmát, ami a faj vagy fajta genetikailag meghatározott tulajdonsága. Ugyanakkor a morfogenetikai potenciál megvalósulását az embriók in vitro tenyésztésében, a Cerasus vulgaris, C. maackii, C. fruticosa, Padus racemosa fajok közötti hibridekben elsősorban a genotípus, illetve kisebb mértékben a a tápközeg összetételétől függött.

Termesztési feltételek

Egy másik tényező, amely meghatározza a növények mikroszaporításának sikerességét, a termesztés feltételei. Optimális feltételek csonthéjas növények termesztése: hőmérséklet 22-26 ° C cseresznye, cseresznye és 26-28 ° C - szilva, megvilágítás 2000-5000 lux - cseresznye, cseresznye és 3500 lux szilva 16 órás fényperiódussal. A mikronövényeket klímakamrákban vagy ellenőrzött helyiségekben kell nevelni.

Megjegyzendő, hogy a szaporodási szakaszban lévő meggyfajtáknál a szaporodási tényező növelése és a gyökeresedésre alkalmas hajtások arányának növelése biztosíthatja a váltakozás átvételét. ásványi összetételek táptalaj és kék fényű lámpák használata (LP 1) . A csonthéjas növények nagyszámú - akár 30 - hajtása is kialakítható a regeneránsok vízszintes tájolásával. A szaporodási tényező növelése érdekében az első szakaszokban a csonthéjas gyümölcsök rügyei és hajtásai konglomerátumait nem lehet külön egységekre osztani, hanem teljes egészében friss tápközegbe lehet vinni. Ennek a technikának a használatakor a szorzótényező értéke meredeken emelkedik, és fajtától függően elérheti a 40-70-et passzázsonként.

A hónaljrügyekkel történő szaporítás módja indirekt morfogenezis

A mikroszaporítás legmegbízhatóbb módja a hónaljrügyek fejlesztésével történő növényregeneráció. A módszer előnye az eredeti genotípus viszonylag gyors reprodukálása, miközben biztosítja a legmagasabb fenotípusos és genotípusos stabilitást. Az in vitro mikroszaporítási módszerben rejlő lehetőségeket a táptalajokhoz citokininek hozzáadásával valósítják meg, amelyek gátolják a szár apikális rügyének fejlődését és serkentik a hónaljrügyek kialakulását.

A meggy izolált apikális merisztémák tenyésztésével történő mikroklonális szaporításának folyamata az apikális dominancia megszűnésének jelenségén alapul, amely hozzájárul a már meglévő merisztémák későbbi fejlődéséhez, és biztosítja az ültetési anyag genetikai homogenitását.

riál. Az apikális dominancia eltávolítása citokininek hozzáadásával érhető el. Sok cseresznyefajtát a csúcs magas mitotikus aktivitása jellemez, ami hozzájárul a rügyek és oldalsó mikrohajtások elágazó konglomerátumának kialakulásához.

Az in vitro nyert anyag genetikai stabilitása a szaporodási modelltől függ. A termésköves növények szaporodási folyamata a hónaljmerisztémák elszaporodásával jár. A genetikai stabilitás a merisztéma velejárója, amely in vitro megőrizhető, ha az utóbbit olyan körülmények között termesztik, amelyek gátolják a kalluszképződést. Ha a kalluszképződést serkentő közeget használunk, akkor genetikai variabilitás léphet fel.

A magasabb szaporodási faktorok elérése érdekében a tápközeget gyakran a citokinin jellegű készítmények mellett az auxin csoportba tartozó anyagokkal is dúsítják, amelyek serkentik a kalluszszövet fejlődését. E két gyógyszer kombinációit használják a kalluszszövetekben az organogenezis indukálására. A kallusz-hajtás rendszerben a hajtás szervezett felépítése befolyásolhatja az organogenezis folyamatait, serkentve a kalluszsejtek merisztematikusodását, aminek következtében megváltozott tulajdonságú szervek keletkezhetnek. A tápközeghez adott növekedésszabályozók mennyiségének egyszerű változtatása a maximális sejtproliferáció elérése érdekében befolyásolhatja a kapott anyag genetikai stabilitását.

Az adventív rügyek szaporodási módja és indirekt morfogenezis

A véletlen rügyeket olyan rügyeknek nevezzük, amelyek közvetlenül a növényi explantátumok szöveteiből és sejtjeiből származnak, általában nem képezik azokat. Az adventív (vagy adnexális) rügyek merisztéma zónáiból képződnek, leggyakrabban másodlagosan a kalluszszövetekből. A merisztémás és nem merisztémás szövetekből (levelek, szárak) véletlen rügyek keletkezhetnek. A járulékos rügyek kialakulását számos növényfajban a citokininek és az auxinok magas aránya idézi elő a tápközegben.

Az explantátum szomatikus növényi sejtjeiből a hajtások, gyökerek vagy embrioidok regenerációja történhet közvetett regenerációval - kalluszképződéssel és hajtásképzéssel, vagy "közvetlen" regenerációval, amikor az explantált sejtek kalluszszövetek kialakulása nélkül válnak képesek regenerálódni.

Adventív hajtások képződhetnek különféle csonthéjas gyümölcsök és gyümölcskultúrák leveleinek, levélnyéleinek, gyökereinek és egyéb növényi szerveinek explantátumain. A növények klónozására bizonyos esetekben közvetlenül az explantátumból származó hajtásokat alkalmazzák, de ebben az esetben genetikailag instabil növények jelenhetnek meg. Ezért ez a növényregenerációs módszer felhasználható genetikailag változatos növények indukálására.

A levéllemez különböző részeiből regenerálódó hajtások indukálhatók, de a szövetek rendelkeznek a legnagyobb regenerációs képességgel.

a levél alapja, mivel a levéllemez ezen zónájában találhatók a legaktívabb merisztematikus sejtek. Figyelembe kell venni azt is, hogy a levelek morfogenetikai potenciálja növekszik, ha a szár teteje felé helyezkednek el. Az adventív hajtások jobban regenerálódnak a fejlődő levelek fiatal merisztémás szövetéből. Idősebb levelek használata esetén azonban sokkal nagyobb valószínűséggel fordulnak elő génmódosított hajtások.

A csonthéjas termések, mint a cseresznye, cseresznye, őszibarack, sárgabarack hajtásainak regenerálására az eredeti explantátumokból (egész levelek és szegmenseik) különféle táptalajokat használnak: Murashige-Skoog (MB), Lloyd és Mac Cone ( WPM), Driver és Kuniyuki (DKW), Kuren és Lepuavr (QL).

A cseresznye és a cseresznye véletlenszerű regenerációjával kapcsolatos kísérletekhez leggyakrabban a Lloyd and McCone's fás szárú növények táptalajt, a Woody Plant Mediumot (WPM) használják, amelyet különféle növekedésserkentő szerekkel egészítenek ki. Citokininek közül elsősorban a 6-BAP-t, a tidiazuront (TDZ), az auxinokból - NAA-t, IMC-t, 2,4-diklór-fenoxi-ecetsavat (2,4-D) használnak.

Fontos megjegyezni, hogy a külföldi kutatók között nincs egyetértés a TDZ hajtásregenerációban való alkalmazásának hatékonyságát illetően a BAP-hoz képest, az explantátum típusát (egész levelek, keresztirányú vágással vagy szegmentálva) és a termesztés módját illetően. explantátumok (abaxiális vagy adaxiális felszín). fel).

Magas százalékos regenerációt figyeltek meg a cseresznye egész leveles explantátumaiban (a levél központi ereje mentén keresztirányú vágással), amelyeket abaxiális (alsó) felülettel felfelé helyeztek el 2,27 vagy 4,54 |M TDZ + 0,27 |M TDZ + 0,27 | M NUK.

Másrészt a munka azt mutatja, hogy a BAP hatékonyabb a TDZ-nél a növények cseresznye- és cseresznyelevélből történő regenerálásában, és a BAP és a NAA 2 mg/l és 1 mg/l koncentrációban az optimális kombináció a cseresznye és a cseresznye növényi növekedésszabályozói. A regeneráció legnagyobb gyakoriságát a WPM táptalajon kaptuk, bár ez jobban stimulálta a kalluszogenezist, mint az MS, QL, DKW. Feltártuk a kalluszképződés hatékonyságának a levélszegmensek típusától való függését. Így a kalluszképződés legmagasabb aránya a középső levélszegmensekben volt megfigyelhető; a legalacsonyabb értékek az apikális szegmenseken voltak, és közvetlen regeneráció (kalluszképződés nélkül) a bazális szegmenseken volt megfigyelhető.

A feketecseresznye (Prunus serótina Ehrh.) adventív regenerációja gyakrabban fordult elő, ha a levélexplantátumokat TDZ-vel kiegészített WPM táptalajon termesztettük, mint a módosított DKW táptalajhoz képest.

A vadcseresznye (Prunus avium L.) véletlen regenerációjának hatékonyságát jelentősen befolyásolta az explantátum mérete. Az eredmények azt mutatták, hogy a levélexplantátum mérete kritikus a járulékos hajtások kialakulásában, a 3-5 mm hosszú levelek alkották a legtöbb járulékos hajtást. A vadcseresznye véletlen regenerálásához 0,54 tM NAA-val és 4,4 tM TDZ-vel kiegészített WPM-et használtunk.

Egy speciális termesztési előkezelés (5 mg/l 2,4-D áztatás egy napig) hatékony volt a cseresznyelevél-explantátumok járulékos hajtásainak kiváltásában. A későbbi levélexplantátumok 5 mg/l TDZ-vel kiegészített WP regenerációs agar táptalajon történő termesztése növelte a cseresznye véletlenszerű regenerációjának hatékonyságát. A cseresznye fiatal levelei nagyobb regenerációs képességet mutattak, mint a régiek.

Meg kell jegyezni az etilén inhibitorok jelentős hatását a különféle sárgabarackfajták leveleinek véletlen regenerációjára. Például a munkában kimutatták, hogy az etilén-inhibitorok (ezüst-tioszulfát vagy amino-etoxi-vinil-glicin) alacsony kanamicintartalommal együtt történő alkalmazása több mint 200%-kal növeli az esetleges regenerációt. A tiszta agar használata javította a sárgabaracklevél regenerálódását is, összehasonlítva az agar-gél vagy agaróz használatával. Ebben a munkában LQ, DKW médián végeztek vizsgálatokat TDZ-vel és NUK-val kiegészítve. A levelek termesztésének módja - adaxiális felület a környezethez.

Olasz kutatók egy járulékos regenerációs módszert fejlesztettek ki egész őszibarack levelekből, amelyeket sötétben inkubáltak 6-BAP-pal és NAA-val kiegészített táptalajon. A vizsgálatok során különböző táptalajok makrosóinak és mikrosóinak kombinációit alkalmazták MS szerint, Quoirin, Rugini és Muganu, mindkét citokinin - 6-BAP és TDZ, valamint a levéltenyésztés módszere - a regenerációs tápközeggel érintkező adaxiális felület. A kallusz a levélnyél tövében fejlődött ki. Ezen a kalluszon auxinmentes táptalajba helyezés és fény melletti tenyésztés után járulékos hajtások jelentek meg. A kallusz morfogenetikai képessége több hónapig megmaradt. Ezekben a vizsgálatokban az őszibarack járulékos hajtásai közvetett morfogenezis révén jelentek meg.

A közvetett morfogenezis magában foglalja a vesék másodlagos differenciálódását a kalluszszövetektől. Különféle explantátumokat használnak a kallusz kialakítására, amelyből aztán hajtások képződnek. Ahhoz, hogy évelő növényekből morfogén kalluszokat kapjunk, a hajtások tetejét vagy a belőlük izolált merisztematikus szövetek metszeteit kell venni. Az ilyen rendszer a növények in vitro mikroszaporítására a genetikai instabilitás miatt nem javasolt. Az indirekt morfogenezis fontos a szomaklonális variabilitás tanulmányozása és a szomaklonális változatok előállítása szempontjából.

Nagy-Britanniában a Maidstone kísérleti állomás élettani osztályán a Colt cseresznye alanyában a növények szár- és levélkalluszból történő regenerációját vizsgálták. A kallusz iniciációt 2,0-10,0 mg/l NAA-t tartalmazó Mourasige-Skoog táptalajon végeztük. A keletkezett kalluszokat 0,5 mg/l koncentrációban BAP-ot tartalmazó regenerációs táptalajba vittük át. Ebben a cseresznye alanyban lehetőség nyílt bőrkeményedésből származó hajtások regenerációjára.

Az I. V. Michurinról elnevezett Központi Genetikai Laboratóriumban gyökérképződést figyeltek meg a cseresznye egynyári hajtásaiból nyert passzivált kalluszszövetek tenyészetében. Növekedésszabályozókkal ellátott táptalajba való áthelyezéskor merisztematikus képződmények megjelenését figyelték meg.

Szomatikus embriogenezis

A növények in vitro mikroklonális szaporításának másik módja a szomatikus embriogenezis, a csíraszerű struktúrák szomatikus (nem ivaros) sejtekből történő kialakulásának folyamata. Szomatikus embrió - a szövethez fizikailag nem kötődő, független bipoláris struktúra, amelyből struktúra alakul ki, amelyben a szár és a gyökércsúcs egyidejűleg fejlődik.

A sejtek, szövetek és szervek tenyészetében szomatikus embriók képződése történhet közvetlenül vagy közvetve. Közvetlen szomatikus embriogenezis - vegetatív embrió kialakulása az explantált szövet egy vagy több sejtjéből, közbenső kallusz kialakulásának szakasza nélkül. A közvetett embriogenezis több szakaszból áll: az explantátum behelyezése a tenyészetbe, a kallusz növekedésének serkentése és a kalluszsejtekből preembriók kialakulása, a kallusz átvitele növekedési faktorok nélküli tápközegbe, hogy bipoláris embriókat képezzenek a preembriókból.

A munkában a cseresznye alanyok gyökereiből nyert kalluszból történő növényregeneráció lehetőségét vizsgálták. A kalluszokat vagy levágott gyökerekből, vagy steril körülmények között termesztett egész növényekből nyerték ki a cseresznye hajtásainak mikroklónozásával. A Colt cseresznye alanyában az ép növények gyökereiből nyert kallusz hajtásokat és embriószerű struktúrákat alkotott. A cseresznye kalluszokat BAP-val, HA-val és NAA-val kiegészített Murashige-Skoog táptalajon tenyésztettük. A hajtásképződés gyakorisága magasabb volt, mint a párhuzamosan vizsgált almafáké. A regenerálódó növényeket szövettenyésztéssel szaporítottuk és talajba ültettük. A cseresznye alanyokból nyert regenerált növények palántái fenotípusban nem különböztek az eredeti alanyoktól.

A cseresznyefajtákban (Prunus cerasus L.) a szomatikus embriogenezis indukálását figyelték meg, amikor az explantátumokat Murashige-Skoog táptalajon, különféle auxin- és citokinin-kombinációkkal kiegészítették. A szomatikus embriogenezis főként 2,4-D és kinetin kombinációjának alkalmazásakor fordult elő. A szomatikus embriogenezis indukcióját akkor is megfigyelték, amikor 0,1 mg/l IBA-t adtunk az induktív táptalajhoz. A NAA vagy 6-BAP alkalmazása csökkentette a szomatikus embriogenezis indukcióját és növelte az indirekt regeneráció gyakoriságát a cseresznyefajtákban (Prunus cerasus L.).

A genetikailag azonos utódok megszerzésének legmegbízhatóbb módjának mindmáig a köves termések hónaljrügyekkel történő mikroszaporítását tartják, összehasonlítva a szomatikus embriogenezissel, a járulékos rügyekkel történő szaporítással és a közvetett morfogenezissel.

1. Polevoy V. V., Chirkova T. V., Lutova L. A. et al. Workshop a növények növekedéséről és rezisztenciájáról: oktatóanyag. SPb., 2001. S. 208.

2. Sorokina I. K., Starichkova N. I., Reshetnikova T. B., Grin N. A. A növényi biotechnológia alapjai. Növényi sejtek és szövetek kultúrája: Tankönyv. 2002, 45. o.

3. Chernets A. M., Abramenko N. M., Stakanova R. V. Gyümölcsfák és eper vírusmentes klónjainak hosszú távú in vitro tárolási módszerének kidolgozása // A nemzetközi konferencia absztraktjai: A tenyésztett sejtek biológiája és a biotechnológia. Novoszibirszk, 1988.

4. Romanova N. P., Ulyanova E. K. Az eper meriklonok in vitro tárolásáról // Az N. I. Vavilov Növényipari Kutatóintézet tudományos és műszaki közleménye. L., 1990. szám. 204. S. 75-79.

5. Orlova S. Yu. A cseresznyefajták biológiai jellemzői és nemesítési értéke Oroszország északnyugati részén: A dolgozat kivonata. dis. ... cand. biol. Tudományok. SPb., 2002. S. 20.

6. Niino Takao, Tashiro Kazuo, Suzuki Mitsuteru, Ohuchi Susumu, Magoshi Jun, Akihama Tomoya. A cseresznye és a cseresznye in vitro termesztett hajtásvégeinek mélyhűtése egylépéses üvegezéssel // Scientia Horticulturae. 1997. évf. 70. P. 155-163.

7. Vysotsky V. A. Gyümölcsnövények izolált szöveteinek és szerveinek tenyésztése: gyógyulás és mikroklonális szaporodás // Mezőgazdasági biológia: Havi tudományos és elméleti folyóirat. M., 1983. No. 7. S. 42-47.

8. V. V. Faustov, E. V. Oleshko, I. V. Zharkova, Z. M. Asadulaev és Kh.

B., Ismail H. Cseresznye mikroszaporítás // Proceedings of TSKhA. M., 1988. 5. szám, S. 131-148.

9. Növényi biotechnológia: sejtkultúra // Per. angolról. V. I. Negruk / Szerk. R. G. Butenko. M., 1989. S. 233.

10. Demenko V. I., Trushechkin V. G. Cseresznyeszaporítás in vitro módszerrel // Mezőgazdasági biológia: Havi tudományos és elméleti folyóirat. M., 1983. 7. sz.

11. V. I. Kashin, A. A. Borisova, Yu. N. Prikhodko, O. Yu. M., 2001. S. 97.

12. Shipunova A. A. Gyümölcsös növények klonális mikroszaporítása: Az értekezés kivonata. dis. ... cand. mezőgazdasági tudományok. M., 2003. S. 24.

13. Trushechkin V. G., Vysotsky V. A., Oleshko E. V. A csonthéjas gyümölcsök fajtáinak és alanyainak mikroszaporítása: Útmutató. M., 1983. S. 16.

14. W. D. sáv. Körte növények regenerációja hajtás merisztémacsúcsokból, Plant Sci. leveleket. 1979. évf. 16. szám 2/3. R. 337-342.

15. FossardR. A., Bourne R. A. A szövettenyésztési költségek csökkentése kereskedelmi szaporításhoz // Szövettenyésztés kertészeti célokra. Acta Hort. 1977. évf. 78. R. 37-44.

17. Oleshko E. V. A cseresznye alanyainak és fajtáinak klonális mikroszaporításának sajátosságai: A tézis kivonata. dis. ... cand. biol. Tudományok. M., 1985. S. 15.

18. Khaak E. R., Nuust Yu. O. A csonthéjas gyümölcsök klonális mikroszaporítása // Kertészet és szőlőtermesztés. M., 1989. No. 1. S. 27-29.

19. Dudchenko O.P. Regeneráció izolált szilvamerisztémák kultúrájában // A „Tenyésztett sejtek biológiája és biotechnológia 2” nemzetközi konferencia absztraktjai. Novoszibirszk, 1988. S. 358.

20. Kornatsky S. A., Vysotsky V. A., Trushechkin V. G. A csonthéjas gyümölcsök klonális mikroszaporításának problémái // Achievements in the fruit production in the Non-Csernozjom zóna az RSFSR: Szo. tudományos művek. M., 1991. S. 104-116.

21. Gyümölcs- és bogyós növények morfogenezisének és szövetszelekciójának indukálása: Útmutató / Szerk. V. E. Perfilieva. 1996, 73. o.

22. Svitailo A. M., Bondarenko P. E., Shevchuk N. S. Gyümölcsnövények alanyainak és fajtáinak klonális mikroszaporítása // A „Tenyésztett sejtek biológiája és a biotechnológia 2” nemzetközi konferencia absztraktjai. Novoszibirszk, 1988. S. 346.

23. Trushechkin V. G., Vysotsky V. A., Kornatsky S. A. A csonthéjas növények klonális mikroszaporítása az egészséges ültetési anyagok termelési rendszerében // A Nemzetközi Konferencia absztraktjai: A termesztett sejtek biológiája és a biotechnológia 2. Novoszibirszk. 1988. S. 319-320.

24. Hammatt N., Grant N. J. Az érett brit vadcseresznye mikroszaporítása // Plant Cell, Tissue and Organ Culture. 1997. évf. 47. P. 103-110.

25. Dzhigadlo M. I. Biotechnológiai és biofizikai módszerek alkalmazása a gyümölcs- és bogyós növények nemesítésében és fajtanemesítésében: Az értekezés kivonata. dis. ... cand. mezőgazdasági tudományok. Michurinsk, 2003, 25. o.

26. Ruzic D., Saric M., Cerovic R., Culafic I. A makroelemek koncentrációja, felvételük és a Gisela 5 cseresznye alany szaporodása közötti kapcsolat in vitro // Plant Cell Tissue Organ Cult. 2000 évf. 63. P. 9-14.

27. Kornatsky S. A. A szilva klonális mikroszaporításának sajátosságai a javított ültetési anyagok rendszerében: A dolgozat kivonata. dis. ... cand. mezőgazdasági tudományok. M., 1991. S. 24.

28. Dzhigadlo M. I., Dzhigadlo E. N. A cseresznye szaporítása apikális merisztéma módszerével // Gyümölcs- és bogyós növények választékának és progresszív termesztési módszereinek javítása: Gyűjtemény. Tula, 1988, 65-68.

29. Vysotsky V. A., Oleshko E. V. A tápközeg javítása a cseresznye klonális mikroszaporításához // Gyümölcsnövények mezőgazdasági technológiája és fajtatanulmánya: Szo. tudományos művek. M., 1985. S. 72-76.

30. Chernets A. M. Az ásványi táplálkozás hatása a cseresznyefajták in vitro proliferációjának intenzitására // A „Tenyésztett sejtek biológiája és biotechnológia 2” nemzetközi konferencia absztraktjai. Novoszibirszk, 1988. S. 343.

31. Nedelcheva S., Ganeva D. In vitro reprodukció három vegetatív szubsztrátumon a Prunus nemzetségből // Rasten. Tudományok. 1985. V. 22. No. 8. S. 98-104.

32. Boleriola-Lucas C., Millins M. G. Két francia aszalt szilvafajta (Prunus domesticaL.) mikroszaporítása // Agronomie. 1984. évf. 4. No. 5. R. 473-477.

33. Vysotsky V. A., Oleshko E. V. A mikrooltás alkalmazása csonthéjas termések klonális mikroszaporításában // Mezőgazdasági biológia. M., 1988. No. 4. S. 75-77.

34. Plaksina T.V. Biotechnológia felhasználása a cseresznyenemesítésben Altájban // A NIISS im. 70. évfordulója alkalmából rendezett tudományos és gyakorlati konferencia anyaga. M. A. Li-savenko: A kertészet fenntartható fejlődésének problémái Szibériában. Barnaul, 2003, 108-110.

35. Vysotsky V. A. Egyes növekedésszabályozók hatása a feketeribizli elszigetelt merisztematikus csúcsaira // Plodovodstvo i berry-growing of the non-chernozjom zone: Collection. M. 1979. IX. kötet. 101-107.

36. LutovaL. A. A magasabb rendű növények biotechnológiája: Tankönyv. SPb., 2003. S. 227.

37. Vysotsky V. A. A genetikai stabilitásról a gyümölcs- és bogyós növények klonális mikroszaporítása során // Mezőgazdasági biológia. 1995. No. 5. S. 57-63.

38. De Klerk G.-J. Arnholdt-Schmitt B., Lieberei R. Gyökerek, hajtások és embriók regenerációja: fiziológiai, biokémiai és molekuláris vonatkozások // Biology Plantarum. Vol. 39. No. 1. 1997. R. 53-66.

39. Tang H., Ren Z., Reustle G., Krczal G. Növényregeneráció édes- és meggyfajták leveleiből // Scientia Horticulturae. 2002. évf. 93. P. 235-244.

40. Bhagwat B., David Lane W. In vitro hajtásregeneráció a cseresznye (Prunus avium) "Lapins" és "Sweetheart" leveleiből // Plant Cell, Tissue and Organ Culture. Netherlands. 2004. Vol. 78. P. 173 -181.

41. Gentile A., Monticelli S., Damiano C. Adventív hajtásregeneráció barackban, Plant Cell Reports. 2002. évf. 20. P. 1011-1016.

42. Takashina T., Nakano H., Kato R. Hatékony növényregenerációs kultúra in vitro termesztett cseresznye levélexplantátumaiból // Acta Horticulturae: XXVI International Horticultural Congress: Genetics and Breeding of Tree Fruits and Nuts. R. 622.

43. Burgos L., Alburquerque N. Az etilén-inhibitorok és az alacsony kanamicin-koncentráció javítja a sárgabaracklevelek véletlen regenerációját // Plant Cell Reports. 2003. évf. 21. P. 1167-1174.

44. Hammatt N., Grant N. J. Shoot regeneration from leaves of Prunus serotina Ehrh. (fekete cseresznye) és P. avium L. (vadcseresznye) // Plant Cell Reports. 1998. évf. 17. P. 526-530.

45. Grant Neil J., Hammatt Neil. Adventív hajtásfejlődés vadcseresznye (Prunus avium L.) leveleiből // Új erdők. Hollandia. 2000 évf. 20. P. 287-295.

46. ​​James D. E., Possey A. J., Mahotro S. B. Organogenesis in kallusz, amely alma és cseresznye alanyok szár- és levélszöveteiből származik, Plant Cell Tissue Organ Cult. 1984. évf. 3. 4. sz.

47. Tyulenev V. M., Naftaliyev N. M., Osipova L. V., Rastorguev S. L. Gyümölcsnövények értékes genotípusainak klonális mikroszaporítása // A "Tenyésztett sejtek biológiája és a biotechnológia 2" nemzetközi konferencia absztraktjai. Novoszibirszk, 1988, 320. o.

48. Jones OP, Jacqueline A. Gayner és Watkins R. Növényregeneráció a Colt cseresznye gyökértörzs (Prunus avium x P. pseudocerasus) és az almagyökértörzs M. 25 (Malus pumila) kalluszszövetkultúráiból // The Journal of Kertészettudomány. Anglia. 1984. évf. 59. No. 4. P. 463-467.

49. Tang Haoru, Ren Zhenglong, Krczal Gabi. Szomatikus embriogenezis és organogenezis három meggyfajta (Prunus cerasus L.) éretlen embriószikleveleiből // Scientia Horticulturae. 2000 évf. 83. P. 109-126.

V. Rogovaia, M. Gvozdev

Csonthéjas-gyümölcskultúrák IN VITRO KLONÁLIS MIKROSZAPORÍTÁSA

Az áttekintés a csonthéjas gyümölcs kultúrák in vitro klonális mikroszaporításának főbb szakaszaira és módszereire összpontosít. Különös hangsúlyt fektetnek a segédrügyszaporítási technikára és a meggy, cseresznye, őszibarack és sárgabarack levélexplantátumaiból történő véletlen hajtásregeneráció módszerére. Áttekintették a vírusfertőzésekre vonatkozó növényi anyagok vizsgálatának egyes szempontjait, valamint a genetikai stabilitás megőrzésének bizonyos problémáit a szaporítási modelltől függően.

A sejtek nemcsak in vivo öregednek, hanem in vitro is. Sőt, in vitro körülmények között különösen egyértelműen megnyilvánul a hiperoxia szerepe, amely természetes és látszólag egyetlen tényező az öregedésükben ilyen körülmények között.
1.8.1. Mint ismeretes, a sejtek testen kívüli tenyésztését speciális edényekben (lombikok) végzik légköri nyomáson, következésképpen pO2-on, ami sokkal magasabb, mint a szervezetben szokásosan megállapított értékek. Általában az inkubációs folyadékban a pO2 közel van a levegő pO2-jához. Az O2 molekulák a lombikban lévő tápközeg vékony rétegén keresztül szabadon diffundálnak a sejtek felé, és bennük magas pO2 alakul ki, ami in vivo lehetetlen, vagy mindenesetre meghaladja a megengedett értékeket.
Az öregedés oxigén-peroxid koncepciója szempontjából az in vitro körülmények több mint alkalmasnak tűnnek a sejtöregedés folyamatának vizsgálatára, hiszen ilyen körülmények között az intenzívebben, felgyorsult ütemben megy végbe, és ami nagyon fontos. , „tiszta” formában, pl a testrendszerek bármilyen befolyásának teljes hiányában, ami az in vivo öregedés során következik be. Ez a körülmény számos öregedéselméletet azonnal a másodlagos vagy tisztán spekulatív kategóriájába sorol, hiszen az életkorral összefüggő változások a bennük megfogalmazott rendelkezések végrehajtása nélkül is bekövetkeznek, illetve bekövetkezhetnek. Az, hogy ilyen jelentőséget tulajdonítunk a sejtöregedés jelenségének in vitro, annak köszönhető, hogy ilyen „egyszerű” körülmények között lehet majd gyorsan és kevésbé nehézségek árán megérteni az öregedés fizikai-kémiai alapjait és lényegét. ennek a folyamatnak a biológiája általában.
Jelenleg azonban nincs konszenzus a sejtkultúrák öregedésének és a sejtek elöregedésének okait és mechanizmusait illetően egy többsejtű szervezetben, amint azt a szakirodalom ellentétes álláspontjai igazolják (Kapitanov, 1986). Kanungo (Kanungo, 1982) például, bár úgy véli, hogy egy szervezet öregedésének oka a sejtjeinek öregedése, ugyanakkor úgy véli: „az in vitro körülmények nem felelnek meg a fiziológiásnak és a sejtek tulajdonságainak. módosítható. Ha az in vitro vizsgálatok bizonyos hasznos információ magával a sejttel kapcsolatban korlátozott értékkel bírnak, ha a szervezet egészének öregedéséről van szó.” A fenti állítással csak részben lehet egyetérteni. Valójában az in vitro sejtöregedés nem tükrözheti az egész szervezetben minden szinten fellépő, életkorral összefüggő változások teljes komplex spektrumát, ráadásul nagymértékben meghatározza a benne lévő különféle kapcsolatok rendszere, beleértve a fordítottakat is. Az in vitro körülmények között az öregedés számos, szervezeti szinten megnyilvánuló alapelve értelmét veszti (lásd 1.1.2. fejezet), de ezek egy része tovább működik sejttenyészetekben. Ilyen különösen az öregedési folyamat multifokális jellege, azaz. károsodás kialakulása in különböző részek sejtekben vagy annak különböző molekuláris ciklusaiban, és az öregedés heterokróniája az azonos tenyésztett típusú sejtek között. Ezen túlmenően, ilyen körülmények között a sejtöregedés visszafordíthatatlanságának, ellenőrizhetetlenségének és folytonosságának alapelveinek nyilvánvalóan világosabban kell megnyilvánulniuk.
A sejtek testen kívüli öregedésének vizsgálatában a fenti hiányosságok nem tűnnek alapvetőnek, ha szem előtt tartjuk, hogy a gerontológia egyik fő feladata az összes élő szervezet öregedését meghatározó fő elsődleges környezeti tényező megállapítása. Meggyőződésünk, hogy a Föld légkörében a hiperoxia ilyen tényező, ezért a sejtek in vitro körülmények közötti élete alkalmas kísérleti modellnek tekinthető ennek a fizikai tényezőnek a sejtöregedésre gyakorolt ​​hatásának vizsgálatára. A levegő szokásos 18-21%-os O2 tartalma és ennek megfelelően a Δ (PO - AO) és a peroxigenáz folyamatok kiegyensúlyozatlansága nagymértékben lenyomja a szubcelluláris elemeket, a normál élettani és anyagcsere folyamatokat. Ennek eredményeként az utóbbi fokozatosan elhalványul, és a legtöbb sejt elpusztul az oxidatív citolízis vagy az apoptózis oxigén-peroxid mechanizmusa miatt (lásd 7.1. fejezet).
Több, mint elegendő tény utal arra, hogy a felesleges pO2, ROS és LPO vezető szerepet játszik a sejtek túlélési arányának csökkentésében in vitro körülmények között, valamint a különböző antioxidáns faktorok védő hatásában (Branton et al., 1998; Drukarch és mtsai, 1998; Heppner et al., 1998). Az utóbbi időben az L-karnozin is bekerült az utóbbiak közé. Fiziológiás koncentrációban standard tápközeghez adva megnöveli a humán fibroblasztok élettartamát in vitro, és lelassítja bennük a fiziológiás öregedési folyamatokat. A karnozin tartalmú táptalajba való átvitel után hosszú ideig közönséges táptalajon passzált sejtek fiatalító hatást mutattak. A D-karnozin optikai izomerje nem rendelkezett a jelzett tulajdonságokkal (Hallyday és McFarland, 2000), ugyanakkor a hosszú távú tenyésztés során a sejtek egy része nemhogy nem bomlik le, hanem alkalmazkodik toxikus oxidatív körülmények között, „eléri”, hogy a Δ (PO - AO) intracelluláris paraméter ne emelkedjen magas ΔA2 vagy ΔC értékre, hanem valamivel alacsonyabb ΔK-szinten megálljon, ami szükséges a rosszindulatú átalakulásukhoz. A tenyészetben „spontán” sejtrosszindulatú daganatok eseteit és lehetséges mechanizmusát a 4. fejezetben külön tárgyaljuk.
1.8.2. A fenti megfontolások a sejtöregedés in vitro okaira és következményeire vonatkozó elméleti felvetéseink részének tekinthetők. E rendelkezések megerősítéséhez és továbbfejlesztéséhez természetes, hogy néhány már ismert tényre támaszkodunk, amelyek tartalma és jelentése könnyen „beleírható” a sejtöregedés oxigén-peroxid fogalmába. Kezdjük azzal, hogy a rájuk nézve mérgező sejtek tenyésztésének fent leírt szokásos feltételeit a gáznemű közeg O2 koncentrációjának mesterséges csökkentésével mérsékelhetjük. Ebben az esetben a hiperoxia gátló hatásának és a sejtöregedés ütemének csökkennie kell. Azt is figyelembe kell venni, hogy egy olyan jól ismert biológiai állandó, mint a Hayflick-határérték valójában változó értéknek bizonyult a gáznemű közeg O2-tartalmától függően, és ez a határérték csökken oxidatív stressz körülményei között, és ellenkezőleg, a pO2 csökkenésével nő (Chen et al., 1995).
Valójában a fibroblasztok tenyészetének jelenléte alacsony O2-tartalmú (10%) atmoszférában 20-30%-kal meghosszabbítja élettartamukat. Ugyanez történik az emberi és egér tüdősejtekkel (Packer és Walton, 1977). A populáció megduplázódásának különböző kezdeti szintjével rendelkező diploid humán IMR90 fibroblasztok proliferatív életképességének periódusa a tápközeg O2-tartalmának 1,6-ra vagy 12%-ra csökkenésével nő. Ez az 1% O2 tartalmú időszak 22%-kal növekszik, és a tenyészetek visszatérése az 1% O2 táptalajból a 20% O2 tartalmú táptalajba gyorsan öregedik. Werner-szindrómás (korai öregedés) betegből származó diploid fibroblasztok tenyészetében a replikációs életképesség időtartama is nő a pO2 csökkenésével (Saito et al., 1995). A tenyésztett csirkeembrió kondrociták öregedésének késleltetése 8%-os légköri O2-tartalom mellett a kontrollhoz (18%) képest kimutatható volt, a kísérleti sejtek hosszabb ideig megtartották a „fiatal” jeleit és magasabb volt a proliferáció (Nevo et). al., 1988). Különféle antioxidánsok hatására a sejttenyészetek szaporodási sebessége is megnő, öregedésük lelassul (Packer és Walton, 1977; Obukhova, 1986), ami megerősíti a fentebb már elmondottakat: az oxidánsok egyértelműen túlzott hatása elnyomja a sejtet. elszaporodását és felgyorsult öregedésüket okozza.
Sejttenyészetekkel végzett kísérletekben viszonylag könnyen ellenőrizhető a légúti enzimek (Murphy és mtsai, 1984; Suzuki és mtsai, 1998) és a mitokondriumok (Ozernyuk, 1978) mennyiségét szabályozó O2-függő mechanizmus működése is. ). E mechanizmus szerint a hiperoxia szintjének zökkenőmentes és lassú növekedésével az ilyen enzimek tartalmának és a mitokondriumok számának fokozatosan növekednie kell, hipoxia során pedig éppen ellenkezőleg, csökkennie kell. Valójában, ha a tenyésztett fibroblasztokat alacsony O2-tartalmú táptalajon növesztjük, a citokrómok koncentrációja jelentősen csökken (Pius, 1970). Itt természetesen a légzőrendszernek a pO2 intracelluláris szintjéhez való alkalmazkodásának objektív folyamatáról van szó. Ennél a jelenségnél azonban nem kisebb jelentősége van az adaptáció sebességének, amelytől a tenyésztett sejtek öregedésének intenzitása is függ. Nyilvánvalónak tűnik, hogy a biológiai evolúció folyamatában a többsejtű élőlények fokozatosan alkalmazkodtak a föld légkörének pO2-szintjének fokozatos növekedéséhez is. Ugyanakkor a sejten belül a „mitokondriális” adaptációs mechanizmus tekinthető a leghatékonyabbnak: a légzési lánc enzimek és maguk a mitokondriumok száma önszerveződő rendszer szerint változik, így biztosítja a sejtek integritását és viszonylag normális működését. az intracelluláris pO2 bizonyos evolúcióslag jóváhagyott határokon belüli változásaival.
Egészen más helyzet alakul ki, amikor a sejtek gyorsan átkerülnek egy élő szervezetből in vitro körülmények közé. Hirtelen hiperoxiás állapotba kerülésük egyet jelent azzal, hogy jelentős görcsös zavaró hatást váltanak ki rájuk, amelyre általában véve nincsenek felkészülve. Hogyan reagál az elsődleges sejtkultúra egy ilyen zavarra? Nyilvánvalóan egy bizonyos kezdeti időszakban a táptalaj „stressz” a sejtek számára, és maguk a sejtek állapota ebben az időszakban sokkoló. Ezután egy kis időt fordítanak az antioxidáns jellegű adaptív „intézkedések” előkészítésére és végrehajtására, amelyek ezekben az extrém körülmények között lehetségesek. Valószínűleg ez utóbbinak köszönhetően eleinte nemcsak az oxidatív lebomlás elkerülhető, hanem a proliferációs folyamat serkentésének feltételei is megteremthetők, csökkentve a kezdetben magas, egyértelműen „citotoxikus” intracelluláris ΔC (PO – AO) egyensúlyhiányt. az oxidatív mitogenezishez szükséges szint. Az elsődleges kultúra életének ezt a szakaszát azonban nem korlátozhatja az azt folyamatosan elnyomó hiperoxiás környezet. Ebben a helyzetben maga az adaptív mechanizmus kezd inaktiválódni, az antioxidáns rendszer felhalmozódása csökken, majd ez utóbbi visszafejlődik. Magas LPO-szinten mindenekelőtt a mitokondriumok károsodnak (lásd 1.3. fejezet), amelyek száma adaptív hatásként tovább növekedne a pO2 gáznemű környezetben történő fokozatos növekedése esetén.
Egyrészt a sejt adaptív mechanizmusainak képtelensége a hirtelen fellépő hiperoxia gyors és teljes semlegesítésére, másrészt a mitokondriális kapcsolat nagymértékű sebezhetősége a peroxidatív stresszel szemben meghatározza a sejtdegeneráció visszafordíthatatlan folyamatát a kórkép előfordulása után. „kritikus szintű” károsodás bennük. Itt még egyszer fontos megjegyezni: a mitokondriumokban, mint az O2 fő fogyasztóiban, és ebben az értelemben a sejt antioxidáns rendszerének fő antioxidáns védelmi lépésében bekövetkező destruktív változások nem hagynak reményt a túlélésre a legtöbb sejtben. zord körülmények in vitro, mivel ebben az esetben az adaptáció felborul. Ezek a megfontolások teljes mértékben összhangban vannak a mitokondriális változások elsődleges szerepével az öregedési mechanizmus beindításában, azonban az in vitro tenyésztett fibroblasztokkal kapcsolatban feltételezik (Kanungo, 1980).
A peroxidatív stressz és a toxikus hatás in vitro körülmények között tovább fokozható, ha LPO katalizátorokat, például Fe2+ vagy Cu2+ ionokat viszünk be a táptalajba. Valójában a réz-szulfát 60 mg/l koncentrációban történő hozzáadása a táptalajhoz a rotiferek átlagos élettartamának jelentős, 9%-os csökkenését, valamint az MDA mennyiségének lényegesen érezhetőbb növekedését eredményezte, mint az irányítás. A kísérlet szerzői (Enesco et al., 1989) logikusan úgy vélik, hogy a várható élettartam csökkenése a rézionok általi szabadgyökképző folyamatok felgyorsulásának köszönhető. A réz-szulfát meghatározott koncentrációja optimálisnak bizonyult, mivel a magasabb koncentrációk (90 és 180 mg/l) túl mérgezőek voltak a rotiferekre, az alacsonyabb (30 mg/l) pedig hatástalanok voltak.
Így a sejtek visszafordíthatatlanul felgyorsult öregedése és oxidatív lebomlása az élőhely in vivoról in vitro felé történő éles változása során annak az eredménye, hogy nem voltak eléggé hajlandók elfogadni az oxigénexpozíció ilyen meredek növekedését súlyos negatív következmények nélkül. Ha az új körülményekre való ilyen éles átmenetet egy „puha” váltja fel, például többlépcsős és időben meghosszabbított, akkor várhatóan teljes mértékben megvalósul a sejtekben rejlő képesség, hogy alkalmazkodjanak a fokozatosan növekvő hiperoxiához. Sőt, elvileg így nem csak a légkör szokásos 18-21%-os O2-szintjéhez, hanem a mesterségesen kialakított, ennél lényegesen magasabb hiperoxiás környezethez is el lehet érni a sejtadaptációt. Az elmondottak alátámasztására hivatkozunk azokra a nagyon meggyőző tényekre, amelyeket Welk et al. (Valk et al., 1985). A növekvő O2 koncentrációkhoz való fokozatos alkalmazkodás eredményeként olyan kínai hörcsög petefészek sejtvonalat kaptak, amely ellenáll a magas O2 tartalomnak, és már 99%-os atmoszféra O2 mellett is képes szaporodni. Egy ilyen jelentős hiperoxiához és az attól függő folyamatokhoz a védelem minden szakasza alkalmazkodott - oxigén-, gyök- és peroxid-ellenes (az eredményekről bővebben a 4. fejezetben olvashat).
1.8.3. A fenti megfontolások a tenyésztett sejtek prooxidáns-antioxidáns egyensúlyhiány változásának jellemzőiről, mint az öregedés és átalakulás fő aktív tényezőjéről, feltételesen ábrázolhatók grafikusan is (lásd 11. ábra). Az 1. görbe, amely ezeket a változásokat tükrözi a sejtek gyors in vitro tápközegbe való mozgása során, három egymást követő időbeni szakaszt mutat, amelyek látszólag megfelelnek az adaptív (látens) fázisnak, a logaritmikus növekedési fázisnak és a stacionárius fázisnak, amelyet a témában ismerünk. irodalom. Ebben az esetben a sejttenyészetek öregedését általában az állófázisban lezajló folyamatokhoz kötik, ahol idővel különféle változásokon mennek keresztül, amelyek hasonlóak az öregedő szervezet sejtjeiben megfigyeltekhez (Kapitanov, 1986; Khokhlov, 1988). Különösen az enzimek változnak a sejtöregedés során in vitro, és aneu- és poliploidizációjuk megy végbe (Remacle, 1989). Az in vivo sejtekhez hasonlóan a tenyésztett sejtekben is lipofuscin granulátumok halmozódnak fel az öregedés során (Obukhova és Emanuel, 1984), jelezve a peroxidfolyamatok nyilvánvaló lefolyását, valamint a lipidek és fehérjék szerkezetében fellépő oxidatív zavarokat. Ezek és számos más tény így vagy úgy összhangban lehet az öregedés oxigén-peroxid (szabadgyök) mechanizmusának hipotézisével. Ezt a mechanizmust leginkább azok az adatok támasztják alá, amelyek szerint az antioxidánsok koncentrációjának növekedésével a sejtek élettartama in vitro hosszabb, csökkenésével pedig rövidebb, mint a kontrolléban. Ilyen eredményeket kaptunk például a humán fibroblasztok GSH-tartalmának (Shuji és Matsuo, 1988), a kataláz- és SOD-tartalom változtatásával a tenyésztett neuronokban (Drukarch et al., 1998).
Ami a lapos és viszonylag egyenletesen növekvő 2. görbét illeti a 2. ábrán. A 11. ábra szerint ezek természetét az magyarázza, hogy a sejtben a Δ (PO - AO) egyensúlyhiány prooxidáns komponensének minden kis mesterségesen létrehozott növekedését némi késéssel követi a benne lévő antioxidáns komponens megfelelő adaptív növekedése. Ennek a műveletnek az ismételt megismétlése biztosítja a sejtek alkalmazkodását és túlélését a hiperoxia fokozatos, fokozatos növekedésével.
Mindkét esetben figyeljünk a sejtek úgynevezett „spontán” rosszindulatú daganatos megbetegedéséhez vezető lehetőségekre (lásd 4. fejezet). Ez a jelenség a mi szempontunkból csak azokban a cellákban valósulhat meg, ahol az egyensúlytalanság eléri azt a ΔK értéket, amely következetesen kielégíti az egyenlőtlenséget (lásd 1.1.2. pont)
ΔP (PO - AO), vagy inkább, figyelembe véve az "apoptotikus" egyensúlyhiányt, az arányhoz (lásd a 7.1.1. bekezdést)
ΔA1 (PO - AO) Az ilyen eljárások segítségével végső soron transzformált és daganatos sejtek transzplantálható vonalai jönnek létre, amelyek hosszú távon képesek a szervezeten kívüli létezésre. Az általunk vizsgált problémákkal összefüggésben fontosabb az öregedés és a karcinogenezis kapcsolatának vizsgálatának megközelítési módja meghatározása. Ezek egyike, nevezetesen a tumorsejtek megjelenésének folyamatának tanulmányozása a normál sejtkultúrák öregedése során (Witten, 1986), a legtermészetesebbnek és ezért előnyösebbnek tűnik.

megközelítés. Ha a Δ (PO - AO) egyensúlyhiánya áll fenn a ΔK és ΔC közötti intervallumban, a sejtek A2 típusú apoptózison mennek keresztül (lásd a 7.1.1. szakaszt).
A telomer elmélet szerint a replikatív sejtöregedés, beleértve az in vitro körülményeket is, a telomerek lerövidülésével jár minden mitózis után egy bizonyos minimális hosszig, ami az ilyen sejtek osztódási képességének elvesztését eredményezi (lásd 1.4.3. és 1.4). .4). A kérdéssel kapcsolatos ismert irodalom elemzése azt mutatja, hogy ez a posztulátum bizonyos esetekben nem igazolódik. Példa erre Karman és munkatársai tanulmánya. (Carman és mtsai, 1998) szíriai hörcsög (SHE) diploid embrionális sejtjein végezték el. Ezek a sejtek 20-30 megkettőzési ciklus után abbahagyták a proliferációt, és a szérumstimulációt követően elvesztették az S-fázisba való belépési képességüket. Ugyanakkor az SHE sejtek a teljes replikációs életciklus alatt telomerázt expresszáltak, és az átlagos telomerméret nem csökkent. Kiderült, hogy az in vitro sejtek olykor olyan mechanizmusok miatt öregedhetnek, amelyek nem kapcsolódnak a telomerek elvesztéséhez.
Számunkra úgy tűnik, hogy ebben az esetben a táptalaj hiperoxia körülményei maguktól módosítják. Ha mérsékelten megemelkedett ROS-szint és peroxidáció esetén gyakran pozitív funkciókat lát el, aktiválva a mitogén jel áthaladásának egyes szakaszait, a replikációt, a transzkripciót és más folyamatokat (erről több korábbi bekezdés is szó esett, és említésre került a néhány későbbi), akkor intenzív oxidatív stressz esetén elkerülhetetlen és negatív következményekkel jár. Például egyes makromolekulák, köztük a mitogenezisben részt vevők módosíthatók, amelyek a telomeráz aktivitástól és a telomerhossztól függetlenül gátolják a proliferációt és/vagy más rendellenességeket indukálnak, a sejthalálig bezárólag.
Bárhogy is legyen, a sejtek in vitro öregedésének két oka – a hibák felhalmozódása a tenyésztésben való fenntartásuk körülményei között és a telomerek lerövidülése – továbbra is a legvalószínűbb. Úgy gondolják, hogy mindkét esetben a p53 és Rb fehérjerendszer aktiválódik, és ha működésük károsodik, sejttranszformáció következik be (Sherr és DePinho, 2000). Általánosabban a következőket látjuk: toxikus hiperoxiás tenyésztési körülmények között a normál sejtek öregednek, nagy valószínűséggel A1 apoptózison, a tumorsejtek pedig A2 apoptózison mennek keresztül. Az apoptózis mechanizmusának meghibásodása esetén az előbbiek neoplasztikus átalakuláson, míg az utóbbiak oxidatív citolízisen mennek keresztül (lásd 7.1.1. fejezet).
A sejtek oxidatív bomlási folyamatainak in vitro felerősödéséhez hozzájáruló további okként a hőt is tekinthetjük, mint állandóan ható tényezőt. környezet. Valójában egy nagyon érzékeny módszerrel (Bruskov et al., 2001) kimutatták, hogy ROS-ok vizes oldatokban hő hatására keletkeznek. A vízben oldott légköri O2 termikus aktiválása következtében reakciók sorozata megy végbe.
O2 → 1O2 → O → HO2˙ → H2O2 → OH˙.
A képződött ROS nyilvánvalóan hozzájárul a DNS és más biológiai molekulák termikus károsodásához az "autooxidációjuk" révén.
Végezetül megjegyezzük a sejtöregedés folyamatának in vitro körülmények közötti intenzitásának egy másik módját is, az anoxia-reoxigenizációs eljárással, melynek eredményei véleményünk szerint a legvilágosabban tükrözik az öregedés oxigén-peroxid modelljének lényegét. Az öregedési mechanizmus ebben az esetben két alapvető hatáson alapul: a mitokondriális bázis adaptív csökkenése (gyengülése) anoxia vagy hipoxia során (lásd fent); a lipidperoxidáció és az oxidatív pusztulás egyéb folyamatainak jelentős növekedése a későbbi újraoxigénezés során a pO2 éles növekedése miatt (az anoxiás állapothoz viszonyítva), és a felesleges O2 gyors hasznosításának lehetetlensége az „anoxikus” mitokondriumok által. A peroxidatív stressz mértéke, és ennek következtében a sejtek öregedésének sebessége függ az anoxiás állapotban való tartózkodásuk időtartamától: minél hosszabb ez az időszak, a mitokondriális bázis annál jobban tud alkalmazkodni az alacsony pO2-szinthez, ill. annál jelentősebb lesz a sejtkárosodás az ischaemia megszűnése után.
A következő tény példaként szolgálhat a sejtöregedés megvalósítására a jelzett „forgatókönyv” szerint. Patkányokból izolált hepatociták különböző korúak, 2 órás anoxiának és 1 órás újraoxigénezésnek vetettük alá. Megállapítást nyert, hogy a reoxigenizációs fázisban a hepatociták nagy mennyiségű oxigéngyököt termelnek, amelyek felelősek a membránjuk károsodásáért és az öregedéssel összefüggő egyéb szerkezeti és funkcionális változásokért, és az öreg sejtek érzékenyebbek voltak a reperfúziós sérülésekre (Gasbarrini et al., 1998). ). Hasonló tényekkel foglalkozunk a 4. fejezetben a tenyészetben lévő sejtek öregedésének és „spontán” rosszindulatú daganatos megbetegedésének mechanizmusának tárgyalása kapcsán.

Az in vitro kísérletekhez 11 klinikailag egészséges önkéntes és 36 hősérült beteg teljes vérét használtuk.

2.3. Kutatási módszerek

2.3.1. Immunológiai kutatási módszerek

2.3.1.1. Perifériás vér mononukleáris sejtek spontán és indukált szekréciós aktivitásának értékelése in vitro

A vizsgálat tárgya egészséges önkéntesektől és hősérült betegektől reggel éhgyomorra vett vénás vér volt. A vért heparinnal stabilizáljuk 10 NE/ml sebességgel. A mononukleáris sejtek frakcióját a módszer szerint 1,077 g/ml sűrűséggradiensen izoláltuk centrifugálással (400 g 45 percig), ficoll és verografin alkalmazásával. Az 1,077 g/cm3 sűrűségű táptalaj kialakításához 9%-os (w/v) ficoll-400 oldatot (Diam, Moszkva) és 60%-os hivatalos urografint (Schering, Németország) használtunk. A mononukleáris sejtek opálos gyűrűjét Pasteur pipettával vettük ki az interfázisból, és háromszor mostuk centrifugálással 199-es tápközeggel 689 g mellett 5-7 percig. A mosott és újraszuszpendált sejteket 1 x 107 sejt/ml koncentrációra állítottuk be. Életképességüket 0,2%-os tripánkék oldattal történő festéssel határoztuk meg, életképességük legalább 98%-os volt.

A sejttenyésztést levegőben 5% szén-dioxid-tartalom mellett, 37 0 C hőmérsékleten 1 órán keresztül végeztük. Steril körülmények között a sejtek tartalmát leszívtuk, majd kétszer lemostuk a nem tapadó sejteket Hank-oldattal. Ezután 250 μl 10%-os magzati borjúszérumot és 80 μg/ml gentamicint adtunk minden egyes lyukba. Ezt követően a sejteket 72 órán keresztül, termosztátban 5% levegő szén-dioxid-tartalom mellett tenyésztettük, 37 0 C hőmérsékleten, meghatároztuk a citokinek koncentrációját a felülúszóban.

2.3.1.2. Veleszületett immunitás kutatása

A leukociták számának meghatározása és a leukocita képlet. A perifériás vér leukociták számát a Gorjaev-kamrában a hagyományos melanzs módszerrel határoztuk meg. A leukocita képletet metil-alkohollal rögzített és azúrkék II-eozinnal festett vérkenetben számítottuk ki Romanovsky-Giemsa szerint. 200 leukocitát számoltunk meg eozinofilek, bazofilek, metamyelociták, stab és szegmentált neutrofilek, limfociták, monociták differenciálódásával. Számukat relatív (%) és abszolút ( 10 9 /l) értékben fejeztük ki.

A fagociták funkcionális aktivitását az NBT-teszt és a fagocitózis szempontjából vizsgáltuk.

A perifériás vér fagocitáinak abszorpciós képességének vizsgálata latex részecskeabszorpciós modellen végeztük. A fagocitózis meghatározásához 200 μl vért kevertünk össze 20 μl monodiszperz (átmérő 1,7 μm) polisztirol latex szuszpenziójával. A szuszpenzióból 60 perces inkubálás után 37 0 C-on preparátumokat készítettünk, amelyeket megszárítottunk, metanollal fixáltunk és azúrkék II - eozinnal festettük Romanovsky-Giemsa szerint. Immerziós mikroszkóppal vettük figyelembe a fagocitózis aktivitását - a legalább egy latexszemcsét befogó sejtek %-át, a fagocitózis intenzitását - a felszívódott latex mikrogömbök számát 100 megszámlált sejtben, valamint a fagocitaszámot - az abszorbeált latex számát. mikrogömbök fagocitánként.

NST-teszt A nitrokék tetrazólium (NBT) fagociták által oldhatatlan formájába - diformazán - redukciójának intenzitását figyelembe véve végeztük az A.N. módszere szerint. Mayansky és M.E. Viksman (1979). Spontán és indukált NBT-tesztet végeztünk.

A 0,2 ml vért tartalmazó kémcsövekbe 0,1 ml standard hígított nitro-kék-tetrazólium 0,1 M foszfátpufferrel (pH 7,4) készült 0,2%-os oldatát adtuk. Az indukált HBT teszt értékeléséhez 20 μl monodiszperz (1,7 μm átmérőjű) polisztirol latex részecskékből álló szuszpenziót (indukált sorozat) vagy 20 μl 0,9%-os NaCl-t (spontán sorozat) adtunk minden egyes lyukba. 30 perces, 37 °C hőmérsékleten végzett inkubálás után a reakcióelegyhez 3 ml 0,1%-os sósavat adtunk a reakció leállítására. A csöveket 1000 fordulat/perc sebességgel centrifugáltuk 5 percig. A felülúszót eldobtuk, az üledékből keneteket készítettünk. Szárítás után a preparátumokat metanollal fixáltuk és 5 percig 0,1%-os vizes szafranin oldattal festettük. Mikroszkóppal 90x10x1,5-ös nagyítással meghatároztuk az NBT-t visszaállító sejtek százalékos arányát és a reakció intenzitását az NBT redukciós aktivitása szerint, amelyhez az NBT-pozitív sejteket 3 csoportba osztották:

1 - diformazan szemcséket tartalmazó sejtek a citoplazmában, amelyek összterülete kisebb, mint a sejtmag területének 1/3-a;

2 - sejtek diformazan szemcsékkel a citoplazmában a sejtmag területének 1/3-án;

3 - a sejtmag méretét meghaladó diformazan granulátummal rendelkező sejtek.

A reakcióintenzitási együttható meghatározásához az első csoport sejtszámát százalékban kifejezve megszoroztuk 1-gyel, a második csoportban - 2-vel, a harmadikban - 3-mal, az eredményeket összeadtuk és elosztottuk 100-zal.