При далечна хибридизация се използват такива методи за изолирана тъканна култура като ин витро оплождане, ембриокултура (отглеждане на изолирани ембриони върху изкуствени хранителни среди), клонално микроразмножаване на ценни хибриди, както и ин витро производство на хаплоиди и криоконсервация.

Ин витро оплождане (преодоляване на несъвместимостта на програмата)се извършва в случай, когато е невъзможно да се извърши оплождане между избраните двойки в естествени условия. Това се дължи на няколко причини: 1) физиологични (несъответствие във времето на съзряване на прашеца и др.); 2) морфологични (къса поленова тръба или блокиране на нейния растеж на различни етапи на развитие и др.). Оплождането in vitro може да се извърши по два начина: а) култивиране върху изкуствена агарова хранителна среда на яйчника с нанесен върху него готов прашец; б) яйчникът се отваря и парчета от плацентата с яйцеклетки се пренасят в хранителната среда, близо до която или директно върху тъканите на плацентата се култивира готов прашец. Възможно е визуално да се определи дали ин витро оплождането е преминало или не чрез бързо увеличаване на размера на яйцеклетките. Формираният ембрион, като правило, не преминава в латентно състояние, а веднага покълва и поражда хибридно поколение. Плацентарното оплождане in vitro направи възможно преодоляването на несъвместимостта при кръстосване на сортове култивиран тютюн N. tabacum с диви видове N. rosulata и N. debneyi и направи възможно получаването на междувидови хибриди на тютюна в експериментите на M. F. Ternovsky et al. ( 1976), Шинкарева (1986) .

Преодоляване на постгамната несъвместимост.След оплождането възниква постгамна несъвместимост с далечна хибридизация. Това често води до образуването на тънки непокълнали семена. Причината може да е несъответствие във времето на развитие на ембриона и ендосперма. Поради слабото развитие на ендосперма ембрионът не може да покълне нормално. В такива случаи ембрионът се изолира от зряло зърно и се отглежда в хранителна среда.

Отглеждането на ембриони в изкуствена хранителна среда се нарича култура на ембриони. Средата за отглеждане на зрял ембрион може да бъде проста, без добавяне на физиологично активни вещества (например среда на Уайт) или всякакви други, съдържащи минерални соли и захароза. При по-отдалечени кръстосвания вече в ранните етапи могат да се наблюдават нарушения в развитието на ембриона, което се изразява в липса на диференциация, бавен растеж. В този случай културата на ембриона се състои от два етапа - ембрионалния растеж на ембриона, през който продължава диференциацията му, и покълването на израсналия ембрион. Първият етап изисква по-сложна среда с високо съдържаниезахароза, с добавки от различни аминокиселини, витамини и хормони.

Използването на ембрионална култура в развъждането придобива в последните времена голямо значениеза получаване на далечни хибриди на зърнени, зърнени и други земеделски култури. Показана е възможността за повишаване на добива на хибриди пшеница-ръж чрез отглеждане на незрели ембриони, както и използването на ембрионална култура за преодоляване на постгамната несъвместимост при хибридизацията на пшеница с решетка.

Методът на ембрионална култура се използва все по-често при междувидовата хибридизация на зеленчукови растения. За лука са разработени техники за отглеждане in vitro на абортивни ембриони от хибридни семена от различни етапи на ембриогенеза, отглеждане на ембриони от частично фертилни междувидови хибриди. Културата на изолирани ембриони се използва при отглеждането на домати и други зеленчукови растения.

Изследвана е хормоналната регулация на растежа и развитието на доматените ембриони in vitro. Обсъжда се възможността за използване на ембрионална култура за получаване на отдалечени слънчогледови хибриди, изследват се факторите, контролиращи растежа и развитието на слънчогледови ембриони, изолирани в различно време след опрашване in vitro.

Културата на изолирани ембриони като спомагателен метод за дистанционна хибридизация се използва не само за преодоляване на постгамната несъвместимост, но и за микроразмножаване на ценни хибриди. В този случай микроразмножаването протича чрез калусогенеза, индукция на морфогенеза и производство на регенерирани растения от калусна тъкан. Техниката на клониране на незрели ембриони прави възможно размножаването на ценни растителни генотипове на ранен етап жизнен цикъл. Друга възможност за използване на културата на ембриони е използването й при селекция на клетки.

Клонално микроразмножаване на далечни хибриди.Ембриокултурата прави възможно отглеждането на хибридни растения от дефектни ембриони. Въпреки това, добивът от хибридни растения е нисък, а хибридите често са стерилни. Понякога, например, при отглеждане на елда е трудно да се възпроизведат уникални генотипове в потомството поради кръстосано опрашване на културата. Поради това изследователите често се сблъскват със задачата да размножават и запазват получените растения. Методът на клонално микроразмножаване помага за това. Хибридите се размножават чрез активиране на развитието на меристемата на аксиларната пъпка (чрез изрязване на стерилни издънки), чрез случайни пъпки или чрез регенериране на растения от калусна тъкан, по-специално получени чрез култивиране на ембриони.

Получаване на хаплоиди in vitro и тяхното използване в развъждането.Ролята на хаплоидните растения в размножаването е много голяма. Използването им ви позволява бързо да намерите правилната комбинация, намалява времето за създаване на разнообразие. Хаплоидите се използват за получаване на стабилни хомозиготни линии. За мутагенеза също е по-удобно да се използват хаплоиди, тъй като селекцията на рецесивни мутации се улеснява на хаплоидно ниво.

При диплоидни растения мутациите рядко засягат и двата алелни гена на хомоложни хромозоми. Индивидът обикновено е хетерозиготен (два гена са различни) и само доминантният (но не и рецесивен) ген е засегнат. Тъй като мутациите са по-често рецесивни, отколкото доминантни, те са доста трудни за идентифициране. При хаплоидни растения, които съдържат само по една от всяка двойка хомоложни хромозоми, мутациите се появяват незабавно. Селекцията на хаплоидно ниво позволява директен подбор не само на доминантни, но и на рецесивни черти.

Хаплоидните индивиди са стерилни, но е възможно изкуствено да се удвои техният хромозомен набор с колхицин и да се получат диплоидни хомозиготни растения.

Хаплоидите могат да възникнат спонтанно, но честотата на спонтанната им поява е много ниска. Изкуствено, използвайки in vitro методи, е възможно да се получат голям брой хаплоидни растения. Има три начина за получаване на хаплоиди чрез метода на изолирана тъканна култура:

андрогенеза - получаване на хаплоидни растения върху изкуствена хранителна среда от изолирани прашници и микроспори.

гиногенеза - получаване на хаплоидни растения върху изкуствена хранителна среда от изолирани яйцеклетки;

партеногенеза - получаване на хаплоиди от хибриден ембрион, при който поради несъвместимост на хромозомите на родителите се губят бащини хромозоми.

Хаплоидни ембриоиди, образувани в резултат на елиминирането на хромозомите на бащиния геном, се култивират върху изкуствени хранителни среди и се получават хаплоидни растения. Сортовете ечемик Исток и Одеса-15 са получени чрез комбинация от партеногенетичния метод с културата на изолирани ембриони за четири години вместо обичайните 10–12 години. Над 2,5 хиляди дихаплоидни линии, които се характеризират с хомогенност и стабилност, са получени по метода на прашниковата култура от сортове и хибриди мека и твърда пшеница в НПО Елита Поволжя за четири години.

Продължава развитието на технологията за получаване на хаплоиди чрез отглеждане на прашници от пшеница, ечемик, царевица, зимна ръж, картофи. В културата на прашниците са възможни два начина за образуване на хаплоидни растения. Първият е образуването на растения чрез ембриогенеза в поленовите зърна. В същото време ембриоидите възникват от отделни поленови зърна вътре в прашниците. Те покълват и произвеждат хаплоидни растения. Второто е образуването на калус от клетките на прашниците. Впоследствие, в резултат на морфогенезата, растенията се регенерират от калусни клетки. В този случай получените растения не винаги са хаплоидни и често се различават по плоидност. Не е напълно ясно дали те се образуват от полиплоидизирани хаплоидни клетки или от слети клетки.

Хаплоидите, получени in vitro, могат да се използват не само в практическата селекция, но и в генното инженерство и клетъчната селекция. В някои случаи поленовите зърна са по-удобни обекти от протопластите за експерименти по генетична трансформация.

Криоконсервация на растенията

Криоконсервирането на растителни соматични клетки в течен азот (температура - 196°C) е ново направление в биотехнологиите, което се развива широко от началото на 70-те години на XX век. Целта на тази технология е да запази генофонда в ин витро културата, както и да предостави на селекционерите по всяко време генотип, който притежава желаните характеристики: необходимия прашец за хибридизация; уникални и единични семена, включително тези, които не издържат на дехидратация; трансформирани, мутантни, хибридни клетки различни видоверастения, способни на in vitro морфогенеза; зиготни и соматични ембриони и др. В момента са разработени условия за криоконсервация за култивирани клетки от повече от 30 вида, калусни култури (около 10 вида), изолирани протопласти (8 вида), запазване на меристеми (25 вида) и върхове на стъбла (13 вида). Приоритет в това направление принадлежи на Института по физиология на растенията на Руската академия на науките и по-специално на Катедрата по тъканна култура и морфогенеза, ръководена от проф. Р. Г. Бутенко.

При извършване на работа по криоконсервация е необходимо преди всичко да се вземат предвид спецификата на растителните клетки: изберете малки клетки с малка вакуола и ниско съдържание на вода; да се разработят подходи за замразяване и последващо размразяване на растителни клетки във всеки отделен случай. При криоконсервацията се срещат редица трудности, една от които е свързана със защитата на замразените клетки и тъкани от осмотичен стрес и механично разрушаване на структурите в резултат на образуването и растежа на ледени кристали вътре в клетката. В същото време е необходимо правилно да се изберат условията, които осигуряват висока преживяемост на клетките по време на размразяване и рекултивация.

Въпреки разнообразието от работи в тази посока, те все пак очертават общи техники, залегнали в основата на криоконсервацията: обработка на клетките преди замразяване, използване на криопротектори, спазване на определен режим на замразяване в диапазона от 0 до –40°C (в редки случаи до -70°C). C), както и специални предпазни мерки при размразяване на предмети.

Процесът на криоконсервация, като правило, започва с подготовката на клетъчната култура за замразяване. Това може да се постигне по няколко начина, включващи култивиране на клетки върху хранителни среди, съдържащи различни осмотично активни вещества: манитол или сорбитол в концентрация 2-6%, аминокиселини и сред тях преди всичко пролин, чието значение за свързването на водата в растителните клетки е широко известно, както и у-аминомаслената киселина.

Изборът на криопротектори, вещества, които намаляват увреждането на клетките от осмотичен и механичен стрес, се извършва емпирично на принципа на най-ниска токсичност и оптимален ефект. Сред всички известни криопротектори има такива вещества, които лесно проникват в клетките, като диметилсулфоксид (DMSO, 5–10%), глицерол (10–20%), както и непроникващ поливинилпиролидон с високо молекулно тегло (PVP), декстран, полиетилен гликол (PEG) с молекулно тегло 6000.

От голямо значение при криоконсервацията е правилно избраният режим на замразяване от 0 до –40 ° C. Като правило за всички обекти се задава скорост на замръзване от 0,5–1 ° C в минута и цялата тази работа се извършва на специално оборудване който осигурява замразяване на софтуера. Такива устройства се произвеждат от специално конструкторско технологично бюро с пилотно производство в Института по проблеми на криобиологията и криомедицината (Харков).

По този начин бавното замразяване и използването на криопротектори правят възможно освобождаването на клетката от свободна вода, а при –40°C клетките се дехидратират напълно, което прави възможно по-нататъшното замразяване, а именно потапянето на ампулите с растителен материал в течен азот.

Съхранението на материала в течен азот е практически неограничено. Например, в криобанка на Института по физиология на растенията на Руската академия на науките, клетките на морковите се съхраняват в течен азот за около 20 години, картофените меристеми за повече от 10 години и т.н.

Размразяването и тестването на клетъчната жизнеспособност след съхранение в течен азот е последната стъпка в технологията за криоконсервация. Ако замразяването се извършва бавно, постепенно, тогава размразяването трябва да се извърши възможно най-бързо. За да направите това, ампулите се поставят във водна баня с температура 40 °, а понякога и 60 ° C и се съхраняват, докато последният леден кристал напълно изчезне.

За определяне на жизнеспособността на клетките след размразяване се използва най-простият, бърз и доста задоволителен метод - оцветяване с жизненоважно багрило (0,1% фенозафранин или 0,25% разтвор на Evans blue), в резултат на което се оцветяват мъртвите клетки, но живите не са. Последният критерий, разбира се, е ясно възобновяване на клетъчния растеж и делене по време на рекултивация върху изкуствени хранителни среди след размразяване.

Експериментално е показано, че след съхранение в течен азот клетките не губят способността си да се делят, регенерират растенията, не намалява производителността на синтеза на вторични метаболити (клетки производители) и др. Така Институтът по физиология на растенията на Руската академия на науките, съвместно с НПО за отглеждане на картофи, разработиха методи за криоконсервиране на меристемите на четири сорта картофи и показаха възможността за регенериране на цели растения от 20% от съхраняваните меристеми, които, когато са засадени на полето, не се различават по всички характеристики, включително скоростта на растеж и продуктивността, от обикновените растения от епруветки (S. Manzhulin et al., 1982). Повече подробности за техниката на криоконсервация можете да намерите в рецензиите на A. S. Popov.

Така технологията, свързана с криоконсервацията на растителни обекти, се развива и непрекъснато се подобрява. Без съмнение тази технология има своето бъдеще, тъй като и днес криобанките могат значително да улеснят работата на селекционерите, давайки им възможност да използват широко генофонда от сортове, включително стари селекционни и диви видове, както и застрашени растителни видове.



Б. В. Роговая, М. А. Гвоздев

ОСОБЕНОСТИ НА МИКРОКЛОНАЛНО РАЗМНОЖАНЕ НА КАМЕНТИ КУЛТУРИ ПРИ IN VITRO УСЛОВИЯ

Статията представя обзор, който разглежда особеностите на методите за микроразмножаване на костилкови култури в системата in vitro. Особено внимание се отделя на метода на размножаване чрез аксиларни пъпки и метода за регенериране на придатъчни леторасти от листни растения на череша, череша, праскова и кайсия. Разглеждат се въпросите за оздравяването на растенията от различни патогени и изследването на растителния материал на костилковите култури за наличие на вирусни инфекции.

За първи път микроразмножаването е извършено от френския учен Жорж Морел върху орхидеи през 50-те години на ХХ век. В своите произведения той използва техниката за култивиране на апикалната меристема на растенията. Така получените растения са свободни от вирусна инфекция.

У нас изследванията за подобряване на растенията по меристемния метод и клоново микроразмножаване започват през 60-те години в Института по физиология на растенията. К. А. Тимирязев Академия на науките на СССР.

Микроклонално размножаване - получаване на растения in vitro, които са генетично идентични с оригиналния експлант (метод на вегетативно размножаване на растения в in vitro култура). Микроразмножаването се основава на уникалното свойство на соматичната растителна клетка – тотипотентност – способността на клетките да реализират напълно генетичния потенциал на целия организъм.

Понастоящем все по-важни стават различни методи за микроклонално размножаване на земеделски култури (предимно вегетативно размножени) в системата in vitro: размножаване чрез аксиларни и адвентивни пъпки, индиректна морфогенеза, соматична ембриогенеза.

Използването на тези методи прави възможно:

Ускоряване на процеса на подбор, в резултат на което сроковете за получаване на продаваеми продукти се намаляват на 2-3 години вместо на 10-12;

Да получите за кратко време голямо количество здрав материал без вируси, генетично идентичен с майчиното растение;

Работете в лабораторни условия и поддържайте активно растящи растения през цялата година;

Размножавайте растенията практически без контакт с външната среда, което елиминира въздействието на неблагоприятните абиотични и биотични фактори;

Вземете максималния брой растения на единица площ;

За кратко време за получаване на голям брой растения, които трудно се размножават или не се размножават вегетативно;

При отглеждане на растения с дълга ювенилна фаза е възможно да се ускори преходът от ювенилна към репродуктивна фаза на развитие;

Дълго време (в рамките на 1-3 години) за запазване на растителния материал при условия in vitro (без пасажиране върху прясна среда),

Създаване на банки за дългосрочно съхранение на ценни форми на растения и техните отделни органи;

Разработване на методи за криоконсервация на ин витро дезинфекциран материал.

Етапи на микроразмножаване на костилкови култури и изследване за наличие на вирусни инфекции

Процесът на микроразмножаване включва няколко етапа. Основните са:

1-ви етап - въвеждане на експланта в културата in vitro;

2-ри етап - микроразмножаване;

3-ти етап - процесът на вкореняване на микроиздънки;

4-ти етап - осъществяване на изхода на вкоренени растения от стерилни условия към нестерилни.

Важна стъпка в ин витро микроразмножаването на растенията е култивирането на свободни от вируси майчински форми на растенията в отглеждане или изолирани сандъчета в зимни оранжерии, в условия, недостъпни за вирусните вектори. Растенията донори на експланти за последващо въвеждане в in vitro култура трябва да бъдат тествани за наличие на вирусни, микоплазмени и бактериални инфекции с помощта на PCR диагностични методи, или молекулярна хибридизация, или ензимен имуноанализ (ELISA).

Методът ELISA позволява за кратко време да се открият по-голямата част от вирусите, които инфектират костилковите култури: вирус на сливовото джудже, вирус на некротично пръстеновидно петно ​​на костилковите плодове, потивирус на слива шарка, неповируси на къдрене на листата на череша. След това клонингите, за които е установено, че няма контактни вируси чрез ELISA, се подлагат на основно тестване, което включва серологични тестове в комбинация с тест върху индикаторни растения. Растенията, за които е установено, че са свободни от вируси и други регулирани патогени според резултатите от тестването, се приписват на категорията "безвирусни" основни клонове. Ако се открие инфекция, оригиналните растения могат да бъдат рехабилитирани. За възстановяване на костилковите растения от вируси е най-целесъобразно да се комбинират методите на суховъздушната термотерапия и ин витро културата. Ако култура от изолирани апикални меристеми не успее да се отърве от изследваните вируси, се използват химиотерапевтични методи, базирани на въвеждането на химикали в хранителни среди, които инхибират развитието на вирусна инфекция в растенията in vitro.

Понякога, за да се идентифицира активно бактериалната микрофлора, средата се обогатява с различни органични добавки, например казеинов хидролизат, който провокира развитието на сапрофитни микроорганизми. Инфекцията се оценява визуално след 7-10 дни. "Чисти" експланти се поставят върху хранителни среди за по-нататъшно култивиране. Практикувайте на този етап и използването на среди, лишени от растежни вещества.

Въведение в култура in vitro и микроразмножаване на костилкови плодове

При клоновото микроразмножаване на костилковите култури като източник на експланти обикновено се използват апикални и странични пъпки, както и меристематични върхове. Изолирането на апикалната меристема се извършва по общоприети методи след поетапна стерилизация на растителния материал.

За микроразмножаване на костилкови култури се използват различни среди: за микроразмножаване на череши - среда Пиерик, Гаутре, Уайт, Хелер, за череши и сливи - среда на Розенберг, модифицирана за овощни култури и за сливи - среда Лепойвр и В5. Но най-подходяща за микроразмножаване на череши, череши и сливи е средата Murashige-Skoog (MS).

В зависимост от стадия на микроклонално размножаване на костилковите овощни култури към хранителни среди се добавя 6-бензиламинопурин (6-BAP) в концентрации 0,2-2 mg/l. На етапа на въвеждане в in vitro културата се използва по-ниска концентрация на цитокинин - 0,2 mg/l BAP. За индуциране на пролиферация на аксиларни пъпки с цел получаване на максимален брой издънки се култивират микрорастения череши с добавяне на BAP в концентрации 0,5-2 mg/l, микрорастения слива 0,5-1 mg/l BAP.

Процесът на вкореняване на микроиздънки

Етапът на вкореняване изисква специално внимание. Процесът на вкореняване in vitro издънки на костилкови култури зависи от сортовите характеристики, от броя на извършените пасажи, от концентрацията и вида на ауксина и от начина на неговото приложение. За получаване на напълно оформени микрорастения от костилкови култури, 6-BAP, който предотвратява процесите на ризогенеза, се изключва от средата, а в средата се въвеждат ауксини, главно β-индолил-3-маслена киселина (IMA). Установено е, че оптималната концентрация на ИМК в състава на хранителната среда е в диапазона 0,5-1 mg/l. Наличието на IMC в средата в концентрация 2 mg/l предизвиква образуването на хипертрофирани корени.

Комбинираното въвеждане на препарат рибав (1 ml/l) и традиционни фитохормони ауксини [IMA и β-индолоцетна киселина (IAA) по 0,5 mg/l всеки] в средата за вкореняване увеличава процента на вкореняване на леторастите на редица сортове камъни овощни култури.

При сравнително изследване на индуктори на коренообразуване: IAA, IAA и α-нафтилоцетна киселина (NAA), беше разкрита висока ефективност на IAA при концентрация от 6,0 mg/l. Най-голям брой вкоренени черешови микрорезници е получен на среда, съдържаща NAA. Въпреки това, в същото време се наблюдава интензивен растеж на калуса върху базалната област на леторастите, което затруднява прехвърлянето на епруветки с корени в нестерилни условия.

За ефективното вкореняване на епруветките на костилковите култури от голямо значение е не само видът стимулант, но и начинът на неговото приложение. В допълнение към въвеждането на ауксини в хранителната среда, за предизвикване на ризогенеза, се използва предварително накисване на леторастите в стерилен воден разтвор на IBA (25-30) mg/l при експозиция 12-24 часа. Извършените експерименти показват, че третирането на микроизрезки с воден разтвор на IBA е по-ефективно от въвеждането на този регулатор в хранителната среда. На 20-25-ия ден се отбелязва масовата поява на първите придатъчни корени с използване на предварителна обработка с индуктор на ризогенеза. Друг начин за индуциране на ризогенеза е третирането на леторастите на костилковите овощни култури с талк ауксин-съдържащ IMC прах с концентрация 0,125%, 0,25% и IAA с концентрация 0,25%, 0,5%. При използване на хормонален прах се отбелязва висока ефективност и технологичност на използването на индуктори на ризогенеза. Но използването на IMC талк на прах с различни концентрации на ауксин разкрива сортова специфичност при вкореняването на сливи микрорезници.

Процесът на ризогенеза протича най-интензивно върху модифицирана MS и бяла среда. Според други източници най-добрата среда за образуване на корени са макрохранителните среди на Heller с добавени витамини и полуразредена среда MS с намалено съдържание на захароза от 15 mg/l и с изключение на мезоинозитол, който насърчава образуването на калусна тъкан. Въпреки това, в повечето произведения медиите Murashige и Skoog се използват за вкореняване на микроиздънки на костилкови култури.

Методи за микроразмножаване

Има няколко начина за микроразмножаване на растения in vitro:

Методи за размножаване чрез аксиларни пъпки;

Методи за размножаване чрез случайни пъпки;

Непряка морфогенеза;

соматична ембриогенеза.

За всеки вид ин витро регенерация могат да се разграничат четири групи фактори, които определят нейния успех: генотип и състояние на оригиналното родителско растение; условия и начини на отглеждане; състав на хранителни среди; характеристики на въвеждането на експланта в стерилна култура.

Влияние на генотипа върху ефективността на микроразмножаването

Генотипът има най-значимо влияние върху ефективността на микроразмножаването. Реакцията на растенията към условията на асептично отглеждане зависи от сортовите особености и се обяснява с различната регенеративна способност на сортовете овощни и ягодоплодни култури. Например, когато се използва клоново микроразмножаване за бързо размножаване на нови сортове череши, сортовите черти са установени като доминиращи фактори в способността на растенията да се размножават.

Сортовите различия се проявяват както на етапа на пролиферация, така и на етапа на образуване на корени.

Сред експлантите на различни сортове от един и същи вид овощни растения често има различна степен на проява на реакцията към регулаторите на растежа, включени в средата, което очевидно отразява до известна степен ендогенното съдържание на растежни вещества, което е генетично обусловен признак на вида или сорта. В същото време реализацията на морфогенетичния потенциал в културата на ембриони in vitro, при хибридите между видовете Cerasus vulgaris, C. maackii, C. fruticosa, Padus racemosa се определя основно от генотипа и в по-малка степен, зависи от състава на хранителната среда.

Условия за отглеждане

Друг фактор, определящ успеха на микроразмножаването на растенията, са условията на тяхното отглеждане. Оптимални условияотглеждането на костилкови култури са: температура 22-26°C за череши, череши и 26-28°C - за сливи, осветеност 2000-5000 lux - за череши, череши и 3500 lux за сливи с 16-часов фотопериод. Микрорастенията трябва да се отглеждат в климатични камери или контролирани помещения.

Трябва да се отбележи, че при сортовете череши на етапа на пролиферация увеличаването на коефициента на размножаване и увеличаването на дела на издънките, подходящи за вкореняване, може да осигури приемането на редуване минерални съставихранителна среда и използването на лампи със синя светлина (LP 1) . При хоризонтална ориентация на регенерантите могат да се образуват голям брой издънки на костилковите овощни култури - до 30. За да се увеличи коефициента на размножаване в първите пасажи, конгломератите от пъпки и издънки на костилковите овощни култури не могат да се разделят на отделни единици, а се прехвърлят изцяло в прясна хранителна среда. При използване на тази техника стойността на коефициента на умножение се повишава рязко и може да достигне 40-70 на пасаж, в зависимост от сорта.

Метод на размножаване чрез аксиларни пъпки непряка морфогенеза

Най-надеждният метод за микроразмножаване е методът на регенерация на растенията чрез развитие на аксиларни пъпки. Предимството на този метод е относително бързото възпроизвеждане на оригиналния генотип, като същевременно се гарантира най-висока фенотипна и генотипна стабилност. Потенциалът на този метод за микроразмножаване in vitro се реализира чрез добавяне на цитокинини към хранителни среди, които инхибират развитието на апикалната пъпка на стъблото и стимулират образуването на аксиларни пъпки.

Процесът на микроклонално размножаване на вишни чрез култура на изолирани апикални меристеми се основава на феномена на премахване на апикалната доминация, което допринася за последващото развитие на вече съществуващи меристеми и осигурява генетичната хомогенност на посадъчния материал.

риал. Премахването на апикалната доминация се постига чрез добавяне на цитокинини. Много сортове череши се характеризират с висока митотична активност на върха, което допринася за образуването на разклонен конгломерат от пъпки и странични микроиздънки.

Генетичната стабилност на материала, получен in vitro, зависи от репродуктивния модел. Процесът на размножаване на плодовете костилкови овощни растениясвързани с пролиферацията на аксиларните меристеми. Генетичната стабилност е присъщо свойство на меристемата, която може да бъде запазена in vitro, ако последната се култивира при условия, които инхибират образуването на калус. Ако се използват среди, които стимулират образуването на калус, тогава може да възникне генетична вариабилност.

За да се получат по-високи коефициенти на размножаване, хранителните среди често се обогатяват, освен цитокининовите препарати, с вещества от групата на ауксините, които стимулират развитието на калусната тъкан. Комбинациите от тези две лекарства се използват за индуциране на органогенеза в калусните тъкани. В системата калус-издънка организираната структура на леторастите може да повлияе на процесите на органогенеза, стимулирайки меристемизацията на калусните клетки, което може да доведе до органи с променени свойства. Простото променяне на съдържанието на регулатори на растежа, добавени към хранителната среда, за да се постигне максимална клетъчна пролиферация, може да повлияе на генетичната стабилност на получения материал.

Метод на размножаване чрез адвентивни пъпки и индиректна морфогенеза

Адвентивни пъпки се наричат ​​пъпки, които са възникнали директно от тъканите и клетките на растителните експланти, обикновено не ги образуват. Адвентивните (или аднексалните) пъпки се образуват от меристемни зони, най-често образувани вторично от калусни тъкани. Случайните пъпки могат да възникнат от меристемните и немеристемни тъкани (листа, стъбла). Образуването на адвентивни пъпки при много растителни видове се индуцира от високо съотношение на цитокинини към ауксини в хранителната среда.

Регенерацията на издънки, корени или ембриоиди от соматични растителни клетки на експланта може да се осъществи чрез индиректна регенерация - образуване на калус и образуване на летораст, или чрез "директна" регенерация, когато клетките на експланта стават способни на регенерация без образуване на калусни тъкани.

Адвентивните издънки могат да се образуват върху експланти от листа, дръжки, корени и други растителни органи на различни видове костилкови и овощни култури. Получаването на издънки директно от експланти в някои случаи се използва за клониране на растения, но в този случай може да се появят генетично нестабилни растения. Следователно този метод на регенерация на растенията може да се използва за индуциране на генетично разнообразни растения.

Регенериращите издънки могат да бъдат предизвикани от различни части на листната плоча, но тъканите имат най-голяма способност да се регенерират.

основата на листа, тъй като най-активните меристематични клетки са разположени в тази зона на листната плоча. Трябва също да се има предвид, че морфогенетичният потенциал на листата се увеличава, тъй като те са разположени към върха на стъблото. Адвентивните издънки се регенерират по-добре от младата меристематична тъкан на развиващите се листа. Въпреки това, когато се използват по-стари листа, е много по-вероятно да се появят генетично модифицирани издънки.

За регенериране на издънки на костилкови овощни култури, като череша, череша, праскова, кайсия, от оригиналните експланти (цели листа и техните сегменти) се използват различни среди: Murashige-Skoog (MB), Lloyd и Mac Cone ( WPM), Driver и Kuniyuki (DKW), Kuren и Lepuavr (QL).

За експерименти по случайна регенерация на череши и череши най-често се използва средата на Lloyd and McCone за дървесни растения Woody Plant Medium (WPM), допълнена с различни стимуланти на растежа. От цитокинините се използват основно 6-BAP, тидиазурон (TDZ), от ауксини - NAA, IMC, 2,4-дихлорофеноксиоцетна киселина (2,4-D).

Важно е да се отбележи, че сред чуждестранните изследователи няма консенсус относно ефективността на използването на TDZ при регенерация на леторастите в сравнение с BAP, относно вида на експланта (цели листа, с напречни разрези, приложени към тях или сегментирани) и относно метода на култивиране експланти (абаксиална или адаксиална повърхност). нагоре).

Наблюдава се висок процент на регенерация при цели листни експланти на череша (с напречни разрези по централната жилка на листа), които са поставени абаксиално (долна) повърхност нагоре върху WPM среда, допълнена с 2,27 или 4,54 |M TDZ + 0,27 | М НУК.

От друга страна, работата показва, че BAP е по-ефективен от TDZ при регенерацията на растенията от черешови и черешови листа и че BAP и NAA в концентрация от 2 mg/l и 1 mg/l са оптималната комбинация от регулатори на растежа на растенията череши и череши. Най-високата честота на регенерация е получена на WPM среда, въпреки че тя стимулира калусогенезата повече от MS, QL, DKW. Установена е зависимостта на ефективността на образуването на калус от вида на листните сегменти. По този начин най-високите нива на образуване на калус са отбелязани в сегментите на средния лист; най-ниските стойности са били на апикалните сегменти, а директна регенерация (без образуване на калус) е отбелязана върху базалните сегменти.

Адвентивната регенерация на черна череша (Prunus serótina Ehrh.) се появява по-често, когато листните експланти се култивират върху среда WPM, допълнена с TDZ, в сравнение с модифицирана среда DKW.

Ефективността на случайната регенерация на дивите череши (Prunus avium L.) е значително повлияна от размера на експланта. Резултатите показаха, че размерът на листния експлант е от решаващо значение за образуването на адвентивни издънки, листата с дължина 3-5 мм образуват най-голям брой придатъчни издънки. За случайна регенерация на диви череши се използва WPM, допълнен с 0,54 tM NAA и 4,4 tM TDZ.

Специална предварителна култивационна обработка (накисване с 5 mg/l 2,4-D за един ден) беше ефективна за предизвикване на случайни издънки от експланти на черешови листа. Последващото култивиране на листни експланти върху регенерационна агарова среда WP, допълнена с 5 mg/l TDZ, повишава ефективността на случайната регенерация на череша. Младите листни експланти на череша показват по-висока способност за регенерация от старите.

Трябва да се отбележи значителният ефект на етиленовите инхибитори върху случайната регенерация на листата на различни сортове кайсии. Например, в работата беше показано, че използването на етиленови инхибитори (сребърен тиосулфат или аминоетоксивинилглицин) заедно с ниско съдържание на канамицин увеличава случайната регенерация с повече от 200%. Използването на чист агар също подобрява регенерацията от кайсиевите листа в сравнение с използването на агар гел или агароза. В тази работа бяха проведени проучвания върху LQ, DKW медии, допълнени с TDZ и NUK. Методът на култивиране на листата - адаксиална повърхност към околната среда.

Италиански изследователи разработиха метод за случайна регенерация от цели листа на праскова, които бяха инкубирани на тъмно върху среда, допълнена с 6-BAP и NAA. При проучванията са използвани комбинации от макросоли и микросоли на различни среди според MS, Quoirin, Rugini и Muganu, и двата цитокинина - 6-BAP и TDZ, както и метода на култивиране на листата - адаксиална повърхност в контакт с регенериращата среда. Калусът се развива в основата на листните дръжки. Върху този калус се появяват случайни издънки след прехвърляне в среда без ауксин и култивиране на светлина. Морфогенетичната способност на калуса се запазва в продължение на няколко месеца. В тези проучвания, праскова извънредни издънки се появяват чрез индиректна морфогенеза.

Непряката морфогенеза включва вторична диференциация на бъбреците от калусните тъкани. За образуване на калус се използват различни експланти, от които след това се образуват издънки. За да се получи морфогенен калус от многогодишни растения, трябва да се вземат върховете на леторастите или участъци от меристематични тъкани, изолирани от тях. Такава система не се препоръчва за ин витро микроразмножаване на растения поради генетична нестабилност. Непряката морфогенеза е важна за изследване на сомаклоналната вариабилност и получаване на сомаклонални варианти.

Във Великобритания, в катедрата по физиология на опитната станция Мейдстоун, е изследвана регенерацията на растенията от стъбло и листен калус в подложката на черешата Колт. Инициирането на калуса се извършва върху среда Mourasige-Skoog, съдържаща 2.0-10.0 mg/l NAA. Полученият калус се прехвърля в регенерираща среда, съдържаща BAP в концентрация от 0,5 mg/l. Възможно е да се извърши регенерация на издънки от калуси в тази подложка от череша.

В Централната генетична лаборатория на името на И. В. Мичурин е отбелязано образуване на корени в културата на пасивирани калусни тъкани, получени от едногодишни издънки на череша. При прехвърляне в среда с растежни регулатори се наблюдава поява на меристематични образувания.

Соматична ембриогенеза

Друг метод за микроклонално размножаване на растения in vitro е соматичната ембриогенеза, процесът на образуване на зародишни структури от соматични (неполови) клетки. Соматичен ембрион - независима биполярна структура, неприкрепена физически към тъканта, от която се образува структура, в която върхът на стъблото и корена се развиват едновременно.

Образуването на соматични ембриони в културата на клетки, тъкани и органи може да се случи пряко или косвено. Директна соматична ембриогенеза - образуването на вегетативен ембрион от една или повече клетки на експлантната тъкан без етапа на образуване на междинен калус. Непряката ембриогенеза се състои от няколко етапа: поставяне на експланта в култура, последващо стимулиране на растежа на калуса и образуване на преембриони от калусни клетки, прехвърляне на калус в хранителна среда без растежни фактори за образуване на биполярни ембриони от преембриони.

В работата е изследвана възможността за регенерация на растенията от калуси, получени от корените на черешови подложки. Калусът е получен или от отрязани корени, или от цели растения, отглеждани при стерилни условия чрез микроклониране на черешови издънки. В подложката на черешата Колт калусът, получен от корените на непокътнати растения, образува издънки и ембриоидни структури. Черешовите кали се култивират върху среда Murashige-Skoog, допълнена с BAP, HA и NAA. Честотата на образуване на леторастите е по-висока от тази на ябълковото дърво, анализирано успоредно. Регенеративните растения се размножават чрез тъканна култура и се трансплантират в почвата. Разсад на регенерирани растения, получени от калусите на черешови подложки, не се различават по фенотип от оригиналните подложки.

Индукцията на соматична ембриогенеза в сортовете череши (Prunus cerasus L.) се наблюдава, когато експлантите се култивират върху среда Murashige-Skoog, допълнена с различни комбинации от ауксини и цитокинини. Соматичната ембриогенеза възниква главно, когато се използва комбинация от 2,4-D и кинетин. Индукцията на соматична ембриогенеза също беше отбелязана, когато към индуктивната среда се добави 0,1 mg/l IBA. Използването на NAA или 6-BAP намалява индуцирането на соматичната ембриогенеза и увеличава честотата на индиректната регенерация при сортовете череши (Prunus cerasus L.).

Към днешна дата най-надеждният начин за получаване на генетично идентично потомство се счита за микроразмножаване на плодови костилкови култури с аксиларни пъпки в сравнение със соматичната ембриогенеза, размножаване със случайни пъпки и индиректна морфогенеза.

1. Polevoy V. V., Chirkova T. V., Lutova L. A. и др. Семинар за растеж и устойчивост на растенията: Урок. СПб., 2001. С. 208.

2. Сорокина И. К., Старичкова Н. И., Решетникова Т. Б., Грин Н. А. Основи на растителната биотехнология. Култура на растителни клетки и тъкани: Учеб. 2002, стр. 45.

3. Чернец А. М., Абраменко Н. М., Стаканова Р. В. Разработване на метод за дългосрочно съхранение in vitro на безвирусни клонове на овощни дървета и ягоди // Резюме на международната конференция: Биология на култивираните клетки и биотехнология. Новосибирск, 1988 г.

4. Романова Н. П., Улянова Е. К. За съхранението на ягодови мериклони in vitro // Научно-технически бюлетин на Научноизследователския институт по растениевъдство „Н. И. Вавилов“. Л., 1990. Бр. 204. С. 75-79.

5. Орлова С. Ю. Биологични особености и селекционна стойност на сортовете череши в условията на северозападната част на Русия: Реферат на дисертацията. дис. ... канд. биол. Науки. СПб., 2002. С. 20.

6. Ниино Такао, Таширо Казуо, Сузуки Мицутеру, Охучи Сусуму, Магоши Джун, Акихама Томоя. Криоконсервиране на отгледани ин витро върхове на череша и череша чрез едноетапна витрификация // Scientia Horticulturae. 1997 Vol. 70. С. 155-163.

7. Висоцки В. А. Култура на изолирани тъкани и органи на овощни растения: изцеление и микроклонално размножаване // Селскостопанска биология: Месечно научно-теоретично списание. М., 1983. № 7. С. 42-47.

8. В. В. Фаустов, Е. В. Олешко, И. В. Жаркова, З. М. Асадулаев и Х.

Б., Исмаил Х. Микроразмножаване на череша // Известия на TSKhA. М., 1988. Брой 5. С. 131-148.

9. Биотехнология на растенията: клетъчна култура // Пер. от английски. V. I. Negruk / Изд. Р. Г. Бутенко. М., 1989. С. 233.

10. Деменко В. И., Трушечкин В. Г. Размножаване на череши по метод in vitro // Селскостопанска биология: Месечно научно-теоретично списание. М., 1983. No7.

11. В. И. Кашин, А. А. Борисова, Ю. Н. Приходко, О. Ю. М., 2001. С. 97.

12. Шипунова А. А. Клонално микроразмножаване на овощни растения: Реферат на дисертация. дис. ... канд. селскостопански науки. М., 2003. С. 24.

13. Трушечкин В. Г., Висоцки В. А., Олешко Е. В. Микроразмножаване на сортове и подложки от костилкови овощни култури: Насоки. М., 1983. С. 16.

14. Lane W. D. Регенерация на крушови растения от меристемни връхчета на леторастите, Plant Sci. писма. 1979 Vol. 16. бр.2/3. R. 337-342.

15. FossardR. A., Bourne R. A. Намаляване на разходите за тъканна култура за търговско размножаване // Тъканна култура за градинарски цели. Акта Хорт. 1977 Vol. 78. Р. 37-44.

17. Oleshko E. V. Особености на клоновото микроразмножаване на подложки и сортове череши: Реферат на дисертацията. дис. ... канд. биол. Науки. М., 1985. С. 15.

18. Khaak E. R., Nuust Yu. O. Клонално микроразмножаване на костилкови овощни култури // Градинарство и лозарство. М., 1989. № 1. С. 27-29.

19. Dudchenko O.P. Регенерация в културата на изолирани меристеми на слива // Резюме на международната конференция „Биология на култивираните клетки и биотехнология 2“. Новосибирск, 1988. С. 358.

20. Корнацки С. А., Висоцки В. А., Трушечкин В. Г. Проблеми на клоновото микроразмножаване на костилковите овощни култури // Постижения в овощарството в Нечерноземната зона на РСФСР: сб. научен върши работа. М., 1991. С. 104-116.

21. Индукция на морфогенеза и тъканна селекция на овощни и ягодоплодни култури: Насоки / Изд. В. Е. Перфилиева. 1996, стр. 73.

22. Свитайло А. М., Бондаренко П. Е., Шевчук Н. С. Клонално микроразмножаване на подложки и сортове овощни култури // Резюме на международната конференция "Биология на култивираните клетки и биотехнология 2". Новосибирск, 1988. С. 346.

23. Трушечкин В. Г., Висоцки В. А., Корнацки С. А. Клонално микроразмножаване на костилкови овощни култури в производствената система на здрав посадъчен материал // Резюме на международната конференция: Биология на култивираните клетки и биотехнология 2. Новосибирск. 1988. С. 319-320.

24. Hammatt N., Grant N. J. Микроразмножаване на зряла британска дива череша // Култура на растителните клетки, тъкани и органи. 1997 Vol. 47. С. 103-110.

25. Джигадло М. И. Използване на биотехнологични и биофизични методи в селекцията и сортоотглеждането на овощни и ягодоплодни култури: Реферат на дисертацията. дис. ... канд. селскостопански науки. Мичуринск, 2003, с. 25.

26. Ружич Д., Шарич М., Черович Р., Кулафич И. Връзка между концентрацията на макроелементи, тяхното поглъщане и размножаване на черешови подложки Gisela 5 in vitro // Култ на органа на растителните клетки. 2000 Vol. 63. С. 9-14.

27. Kornatsky S. A. Особености на клоновото микроразмножаване на слива в системата на подобрен посадъчен материал: Реферат на дисертацията. дис. ... канд. селскостопански науки. М., 1991. С. 24.

28. Джигадло М. И., Джигадло Е. Н. Възпроизвеждане на череши по метода на апикалните меристеми // Подобряване на асортимента и прогресивни методи на отглеждане на овощни и ягодоплодни култури: Сборник. Тула, 1988, с. 65-68.

29. Висоцки В. А., Олешко Е. В. Подобряване на хранителната среда за клоново микроразмножаване на череши // Селскостопанска технология и сортово изследване на овощни култури: сб. научен върши работа. М., 1985. С. 72-76.

30. Чернец А. М. Влияние на минералното хранене върху интензивността на пролиферацията на сортовете череши in vitro // Резюме на международната конференция "Биология на култивираните клетки и биотехнология 2". Новосибирск, 1988. С. 343.

31. Неделчева С., Ганева Д. In vitro репродукция върху три вегетативни субстрата от род Prunus // Rasten. Науки. 1985. Т. 22. № 8. С. 98-104.

32. Boleriola-Lucas C., Millins M.G. Микроразмножаване на два френски сорта сини сливи (Prunus domesticaL.) // Agronomie. 1984 Vol. 4. No 5. Р. 473-477.

33. Висоцки В. А., Олешко Е. В. Използването на микроприсаждане при клоново микроразмножаване на костилкови овощни култури // Селскостопанска биология. М., 1988. № 4. С. 75-77.

34. Плаксина Т. В. Използване на биотехнологията в отглеждането на череши в Алтай // Сборник на научно-практическата конференция, посветена на 70-годишнината на НИИСС им. М. А. Лисавенко: Проблеми на устойчивото развитие на градинарството в Сибир. Барнаул, 2003, с. 108-110.

35. Висоцки В. А. Ефектът на някои регулатори на растежа върху изолирани меристематични върхове на касис // Плодоводство и отглеждане на плодове в нечерноземната зона: Сборник. М. 1979. Том IX. с. 101-107.

36. ЛутоваЛ. А. Биотехнология на висшите растения: Учеб. СПб., 2003. С. 227.

37. Vysotsky V. A. За генетичната стабилност по време на клоново микроразмножаване на овощни и ягодоплодни култури // Селскостопанска биология. 1995. № 5. С. 57-63.

38. De Klerk G.-J. Arnholdt-Schmitt B., Lieberei R. Регенерация на корени, издънки и ембриони: физиологични, биохимични и молекулярни аспекти // Biology Plantarum. том 39. No 1. 1997. Р. 53-66.

39. Tang H., Ren Z., Reustle G., Krczal G. Регенерация на растенията от листа от сортове сладки и кисели череши // Scientia Horticulturae. 2002 Vol. 93. С. 235-244.

40. Bhagwat B., David Lane W. In vitro регенерация на издънки от листа на череша (Prunus avium) "Lapins" и "Sweetheart // Plant Cell, Tissue and Organ Culture. Холандия. 2004. Vol. 78. P. 173 -181.

41. Gentile A., Monticelli S., Damiano C. Случайна регенерация на леторастите в праскова, доклади за растителни клетки. 2002 Vol. 20. С. 1011-1016.

42. Такашина Т., Накано Х., Като Р. Ефективна култура за регенерация на растенията от листни експланти на ин витро отгледана сладка череша // Acta Horticulturae: XXVI Международен градинарски конгрес: Генетика и отглеждане на дървесни плодове и ядки. Р. 622.

43. Burgos L., Alburquerque N. Етиленовите инхибитори и ниските концентрации на канамицин подобряват случайната регенерация от кайсиевите листа // Plant Cell Reports. 2003 Vol. 21. С. 1167-1174.

44. Hammatt N., Grant N. J. Регенерация на издънки от листа на Prunus serotina Ehrh. (черна череша) и P. avium L. (дива череша) // Plant Cell Reports. 1998 Vol. 17. С. 526-530.

45. Грант Нийл Дж., Хамат Нийл. Случайно развитие на издънки от листа на дива череша (Prunus avium L.) // Нови гори. Холандия. 2000 Vol. 20. С. 287-295.

46. ​​James D.E., Possey A.J., Mahotro S.B. Органогенеза в калус, получен от стволови и листни тъкани на подложки от ябълка и череша, Култ на органите на растителните клетки. 1984 Vol. 3. № 4.

47. Тюленев В. М., Нафталиев Н. М., Осипова Л. В., Расторгуев С. Л. Клонално микроразмножаване на ценни генотипове на овощни култури // Резюме на международната конференция "Биология на култивираните клетки и биотехнология 2". Новосибирск, 1988, с. 320.

48. Jones O. P., Jacqueline A. Gayner и Watkins R. Регенерация на растенията от калусни тъканни култури от черешов корен Colt (Prunus avium x P. pseudocerasus) и корен от ябълков корен M. 25 (Malus pumila) // The Journal of Градинарска наука. Англия. 1984 Vol. 59. No 4. С. 463-467.

49. Tang Haoru, Ren Zhenglong, Krczal Gabi. Соматична ембриогенеза и органогенеза от незрели ембрионални котиледони на три сорта вишна (Prunus cerasus L.) // Scientia Horticulturae. 2000 Vol. 83. С. 109-126.

В. Роговая, М. Гвоздев

IN VITRO КЛОНОВО МИКРО РАЗмножаване на костилково-плодови култури

Обзорът е фокусиран върху основните етапи и методи на ин витро клонално микроразмножаване на костилкови култури. Специално внимание се отделя на техниката на спомагателно размножаване на пъпките и метода на случайно възобновяване на леторастите от листни експланти на вишна, череша, праскова и кайсия. Прегледани са някои аспекти на тестването на растителен материал за вирусни инфекции, както и някои проблеми на запазването на генетичната стабилност в зависимост от модела на размножаване.

Клетките стареят не само in vivo, но и in vitro. Освен това при условия in vitro особено ясно се проявява ролята на хипероксията, естествен и очевидно единствен фактор за тяхното стареене при тези условия.
1.8.1. Както знаете, култивирането на клетки извън тялото се извършва в специални съдове (колби) с атмосферно наляганеи следователно при рО2 значително надвишаващи стойностите, които нормално се установяват в организма. Обикновено в инкубационната течност рО2 е близо до рО2 на въздуха. Молекулите O2 свободно дифундират към клетките през тънък слой хранителна среда в колба и вътре в тях се установява високо pO2, което е невъзможно in vivo или във всеки случай надвишава допустимите стойности.
От гледна точка на кислородно-пероксидната концепция за стареене, условията in vitro изглеждат повече от подходящи за изследване на процеса на стареене на клетките, тъй като при тези условия той протича по-интензивно, с ускорени темпове и, което е много важно , в „чист” вид, т.е. в пълно отсъствиевсяко влияние на телесните системи, което възниква по време на стареене in vivo. Това обстоятелство незабавно поставя много теории за стареенето в категорията на вторични или чисто спекулативни, тъй като свързаните с възрастта промени настъпват или могат да настъпят дори без прилагането на постулираните в тях разпоредби. Фактът, че придаваме такова значение на феномена клетъчно стареене in vitro, се дължи на факта, че именно при тези „прости“ условия ще бъде възможно бързо и с по-малко трудности да се разберат физикохимичните основи на стареенето и същността на биологията на този процес като цяло.
Понастоящем обаче няма консенсус относно общостта на причините и механизмите на стареене на клетъчни култури и стареене на клетките в многоклетъчен организъм, както се вижда от противоположни гледни точки в литературата (Капитанов, 1986). Канунго (Kanungo, 1982), например, въпреки че вярва, че причината за стареенето на организма е стареенето на неговите клетки, в същото време той вярва: „условията in vitro не отговарят на физиологичните и свойствата на клетките може да бъде променен. Ако изследванията in vitro предоставят някои полезна информацияотносно самата клетка, те са с ограничена стойност, когато става въпрос за стареенето на организма като цяло. Можем само частично да се съгласим с горното твърдение. Всъщност стареенето на клетките in vitro не може да отразява целия сложен спектър от свързани с възрастта промени, настъпващи в целия организъм на всички нива и освен това до голяма степен определяни от системата от различни връзки в него, включително и обратни. По отношение на условията in vitro, редица принципи на стареене, които се проявяват на ниво организм, губят своето значение (вж. Раздел 1.1.2), но някои от тях продължават да действат в клетъчни култури. Такива по-специално са мултифокалният характер на процеса на стареене, т.е. развитие на щети в различни частиклетки или в различните му молекулярни цикли и хетерохронност на стареенето сред клетки от същия култивиран тип. Освен това при тези условия принципите на необратимост, неконтролируемост и непрекъснатост на стареенето на клетките очевидно трябва да се проявят по-ясно.
Горните недостатъци в изследването на клетъчното стареене извън тялото не изглеждат фундаментални, ако се има предвид, че една от основните задачи на геронтологията е да установи основния първичен фактор на околната среда, който определя стареенето на всички живи организми. Такъв фактор, според нас, е хипероксията в земната атмосфераСледователно животът на клетките при in vitro условия може да се счита за удобен експериментален модел за изследване на ефекта на този конкретен физически фактор върху стареенето на клетките. Обичайните 18-21% съдържание на O2 във въздуха и съответно високите нива на дисбаланс Δ (PO - AO) и пероксигеназните процеси имат потискащ ефект върху субклетъчните елементи, върху нормалните физиологични и метаболитни процеси. В резултат на това последните постепенно избледняват и повечето клетки умират поради окислителна цитолиза или чрез кислородно-пероксидния механизъм на апоптоза (вж. Раздел 7.1).
Има повече от достатъчно факти, показващи водещата роля на излишъка на pO2, ROS и LPO за намаляване на оцеляването на клетките при in vitro условия и защитния ефект на различни антиоксидантни фактори (Branton et al., 1998; Drukarch et al., 1998; Heppner и др., 1998). Напоследък L-карнозинът също беше включен сред последните. Добавянето на физиологични концентрации от него към стандартните среди увеличава живота на човешките фибробласти in vitro и забавя процесите на физиологично стареене в тях. Клетките, пасирани върху обикновена среда за дълго време след прехвърляне в среда, съдържаща карнозин, показват подмладяващ ефект. Оптичният изомер на D-карнозин не притежава посочените свойства (Hallyday and McFarland, 2000). В същото време, в хода на продължително култивиране, определен процент клетки не само не се разграждат, но се адаптират към токсични окислителни състояния, „постига“, че вътреклетъчният параметър Δ (PO - AO) не се повишава до високи стойности на ΔA2 или ΔC, но може да спре при малко по-ниско ниво на ΔK, което е необходимо за злокачествената им трансформация. Случаите на „спонтанно” злокачествено заболяване на клетките в културата и възможният му механизъм са разгледани от нас отделно в Глава 4.
1.8.2. Горните съображения могат да се считат за част от нашите теоретични положения за причините и последствията от клетъчното стареене in vitro. За да се потвърдят и развият тези положения, естествено е да се позоваваме на някои вече известни факти, чието съдържание и смисъл лесно могат да бъдат „вписани“ в кислородно-пероксидната концепция за стареенето на клетките. Нека започнем с факта, че гореописаните обичайни условия за култивиране на клетки, които са токсични за тях, могат да бъдат смекчени чрез изкуствено намаляване на концентрацията на O2 в газовата среда. В този случай инхибиторният ефект на хипероксията и скоростта на стареене на клетките трябва да намалеят. Трябва също да се има предвид, че такава добре позната биологична константа като границата на Хейфлик всъщност се оказа променлива стойност в зависимост от съдържанието на O2 в газовата среда и тази граница намалява при условия на оксидативен стрес и на напротив, нараства с намаляване на рО2 (Chen et al., 1995).
Действително, наличието на култура от фибробласти в атмосфера с ниско съдържание на O2 (10%) удължава живота им с 20-30%. Същото се случва с човешки и миши белодробни клетки (Packer and Walton, 1977). Периодът на пролиферативна жизнеспособност на диплоидни човешки IMR90 фибробласти с различни начални нива на удвояване на популацията се увеличава с намаляване на съдържанието на O2 в средата до 1,6 или 12%. Този период при 1% O2 се увеличава с 22%, а връщането на културите от средата с 1% O2 в средата с 20% O2 бързо развива тяхното стареене. В култура от диплоидни фибробласти от пациент със синдром на Вернер (ранно стареене), продължителността на репликативната жизнеспособност също се увеличава с намаляване на pO2 (Saito et al., 1995). Забавянето на стареенето на хондроцитите на култивирани пилешки ембриони е показано при 8% съдържание на O2 в атмосферата в сравнение с контролата (18%), а експерименталните клетки запазват признаците на „млади” за по-дълго и имат по-висока скорост на пролиферация (Nevo et др., 1988). Под въздействието на различни антиоксиданти скоростта на пролиферация на клетъчните култури също се увеличава и тяхното стареене се забавя (Packer and Walton, 1977; Obukhova, 1986), което потвърждава казаното по-горе: явно прекомерното действие на оксидантите потиска клетъчното пролиферация и предизвиква тяхното ускорено стареене.
При експерименти с клетъчни култури също е сравнително лесно да се провери действието на O2-зависимия механизъм за регулиране на количеството на дихателните ензими (Murphy et al., 1984; Suzuki et al., 1998) и митохондриите (Ozernyuk, 1978 ). Съгласно този механизъм, при плавно и бавно повишаване на нивото на хипероксия, съдържанието на такива ензими и броят на митохондриите трябва постепенно да се увеличават, докато по време на хипоксия, напротив, те трябва да намаляват. Всъщност, когато култивираните фибробласти се отглеждат в среда с ниско съдържание на O2, концентрацията на цитохромите е значително намалена (Pius, 1970). Тук, разбира се, участва обективният процес на адаптация на дихателната система към вътреклетъчното ниво на pO2. Въпреки това, при това явление скоростта на адаптация е от не по-малко значение, от което ще зависи и интензивността на стареене на култивираните клетки. Изглежда очевидно, че в процеса на биологичната еволюция многоклетъчният организъм също постепенно се адаптира към постепенното увеличаване на рО2 в земната атмосфера. В същото време "митохондриалният" адаптационен механизъм може да се счита за най-ефективния вътре в клетките: броят на ензимите на дихателната верига и самите митохондрии варират от самоорганизираща се система, така че да гарантира целостта и относително нормалното функциониране на клетките с промени във вътреклетъчния pO2 в определени еволюционно одобрени граници.
Съвсем различна ситуация се развива, когато клетките се прехвърлят бързо от жив организъм в условия in vitro. Рязкото им преминаване в състояние на хипероксия е равносилно на нанасяне върху тях на значителен спазматичен смущаващ ефект, за който, най-общо казано, те не са подготвени. Как първичната клетъчна култура реагира на такова нарушение? Очевидно през определен начален период културалната среда е „стресова“ за клетките, а състоянието на самите клетки през този период е шок. След това се отделя известно време на подготовка и провеждане на адаптивни „мерки” с антиоксидантен характер, които са възможни при тези екстремни условия. Вероятно благодарение на последното в началото е възможно не само да се избегне окислителното разграждане, но и да се създадат условия за стимулиране на пролиферативния процес, като се намали първоначално високият, явно „цитотоксичен” вътреклетъчен дисбаланс на ΔC (PO – AO) до нивото, необходимо за окислителна митогенеза. Но дори този етап от живота на първичната култура не може да не бъде ограничен от хипероксичната среда, която непрекъснато я потиска. В тази ситуация самият адаптивен механизъм започва да се инактивира и съответно натрупването на антиоксидантната система намалява и впоследствие последната регресира. При високо ниво на LPO преди всичко се увреждат митохондриите (вижте раздел 1.3), чийто брой ще продължи да нараства като адаптивен акт в случай на постепенно увеличаване на pO2 в газообразна среда.
Неспособността на адаптивните механизми на клетката бързо и напълно да неутрализират внезапната хипероксия, от една страна, и високата уязвимост на митохондриалната връзка към пероксидативен стрес, от друга страна, определят необратимия процес на клетъчна дегенерация след настъпване на „критично ниво“ на щети в тях. Тук е важно да се отбележи още веднъж: деструктивните промени в митохондриите като основни консуматори на O2 и в този смисъл като основна стъпка на антикислородна защита в антиоксидантната система на клетката не оставят надежда за оцеляване на повечето клетки под тежки условия in vitro, тъй като в този случай се нарушава самата адаптация.-тивен механизъм за намаляване на вътреклетъчните нива на pO2 и LPO. Тези съображения са напълно съвместими с основната роля на митохондриалните промени в инициирането на механизма на стареене, постулирана обаче във връзка с фибробласти, култивирани in vitro (Kanungo, 1980).
Пероксидативният стрес и токсичният ефект при условия in vitro могат да бъдат допълнително засилени, ако LPO катализатори, като Fe2+ или Cu2+ йони, се въвеждат в културалната среда. Действително, добавянето на меден сулфат в концентрация от 60 mg/l към култивационната среда доведе до значително намаляване на средната продължителност на живот на коловратите с 9%, както и до значително по-забележимо увеличение на количеството MDA, отколкото в контролът. Авторите на този експеримент (Enesco et al., 1989) логично смятат, че намаляването на продължителността на живота се дължи на ускоряването на процесите на генериране на свободни радикали от медните йони. Посочената концентрация на меден сулфат се оказва оптимална, тъй като по-високите концентрации (90 и 180 mg/l) са твърде токсични за коловратките, а по-ниската (30 mg/l) е неефективна.
Така необратимото ускорено стареене и окислителното разграждане на клетките по време на рязка промяна на местообитанието от in vivo към in vitro са резултат от недостатъчната им готовност да приемат толкова рязко увеличаване на експозицията на кислород без сериозни негативни последици. Ако такъв рязък преход към нови условия бъде заменен с „мек“, например, многоетапен и удължен във времето, тогава може да се очаква, че способността, присъща на клетките да се адаптират към постепенно нарастваща хипероксия, в този случай е напълно реализирана. Още повече, че по принцип по този начин е възможно да се постигне адаптация на клетките не само към обичайното ниво на O2 в атмосферата от 18-21%, но и към изкуствено създадена хипероксична среда, която е значително по-висока от нея. В подкрепа на казаното се позоваваме на много убедителните факти, получени от Welk et al. (Valk et al., 1985). В резултат на постепенното адаптиране към увеличаване на концентрацията на O2, те са получили клетъчна линия от яйчници на китайски хамстер, която е устойчива на високо съдържание на O2 и способна да се размножава дори при 99% O2 в атмосферата. Към такава значителна хипероксия и зависещи от нея процеси се оказаха адаптирани всички етапи на защита - антикислородна, антирадикалова и антипероксидна (за повече подробности за тези резултати вижте глава 4).
1.8.3. Горните съображения относно особеностите на промените в прооксидантно-антиоксидантния дисбаланс в култивираните клетки като основен активен фактор за тяхното стареене и трансформация могат условно да бъдат представени графично (виж фиг. 11). Крива 1, която отразява тези промени по време на бързото движение на клетките в средата in vitro, показва три последователни етапа във времето, които изглежда съответстват на адаптивната (латентна) фаза, логаритмичната фаза на растеж и стационарната фаза, позната в литература. В този случай стареенето на клетъчните култури обикновено се свързва с процеси в стационарната фаза, където с течение на времето те претърпяват различни промени, подобни на наблюдаваните в клетките на стареещ организъм (Капитанов, 1986; Хохлов, 1988). По-специално, ензимите се променят по време на клетъчното стареене in vitro и настъпва тяхната анеу- и полиплоидизация (Remacle, 1989). Подобно на клетките in vivo, култивираните клетки натрупват липофусцин гранули със стареенето (Obukhova and Emanuel, 1984), което показва очевидното протичане на пероксидните процеси и оксидативните нарушения в структурата на липидите и протеините. Тези и редица други факти, по един или друг начин, могат да бъдат в съответствие с хипотезата за кислородно-пероксидния (свободните радикали) механизъм на стареене. Най-вече този механизъм се подкрепя от данни, че с увеличаване на концентрацията на антиоксиданти животът на клетките in vitro е по-дълъг, а с намаляването е по-кратък, отколкото в контролата. Такива резултати са получени, например, чрез промяна на съдържанието на GSH в човешки фибробласти (Shuji and Matsuo, 1988), каталаза и SOD в култивирани неврони (Drukarch et al., 1998).
Що се отнася до плоските и относително плавно нарастващи криви 2 на фиг. 11, това им естество се обяснява с факта, че всяко малко изкуствено създадено увеличение на прооксидантния компонент на дисбаланса Δ (PO - AO) в клетката е последвано с известно закъснение от съответното адаптивно увеличение на антиоксидантния компонент в нея. Многократното повторение на това действие осигурява адаптацията и оцеляването на клетките с постепенно, стъпаловидно повишаване на нивото на хипероксия.
И в двата случая нека обърнем внимание на вариантите, водещи до т. нар. „спонтанно“ злокачествено заболяване на клетките (вж. Глава 4). Това явление, от наша гледна точка, може да се реализира само в онези клетки, където дисбалансът достига ΔK стойности, които последователно удовлетворяват неравенството (виж клауза 1.1.2)
ΔP (PO - AO), или по-скоро, като се вземат предвид "апоптотичните" дисбаланси, към съотношението (виж параграф 7.1.1)
ΔA1 (PO - AO) С помощта на такива процедури в крайна сметка се формират трансплантируеми линии от трансформирани и туморни клетки, способни да съществуват дълго време извън тялото. В контекста на проблемите, които разглеждаме, по-важно е да се определи подходът за изследване на връзката между стареенето и канцерогенезата. Едно от тях, а именно изследването на самия процес на появата на туморни клетки по време на стареенето на нормалните клетъчни култури (Witten, 1986), изглежда най-естествено и следователно за предпочитане.

Приближаване. Когато се установи дисбаланс на Δ (PO - AO) в интервала между ΔK и ΔC, клетките могат да бъдат подложени на апоптоза тип A2 (вижте раздел 7.1.1).
Според теломерната теория, репликативното клетъчно стареене, включително in vitro условия, е свързано със скъсяване на теломерите след всяка митоза до определена минимална дължина, което води до загуба на способността на тези клетки да се делят (виж раздели 1.4.3 и 1.4). .4). Анализът на известната литература по този въпрос показва, че този постулат не се потвърждава в някои случаи. Пример за това е изследването на Karman et al. (Carman et al., 1998), проведено върху диплоидни ембрионални клетки на сирийския хамстер (SHE). Тези клетки спряха да пролиферират след 20-30 цикъла на удвояване и загубиха способността си да влязат в S-фазата след серумна стимулация. В същото време SHE клетките експресират теломераза през целия репликативен жизнен цикъл и средният размер на теломерите не намалява. Оказва се, че клетките in vitro понякога могат да остареят по механизми, които не са свързани със загубата на теломери.
Струва ни се, че в този случай условията на хипероксия в култивационната среда правят свои собствени корекции. Ако в състояние на умерено повишено ниво на ROS и пероксидацията често изпълняват положителни функции, активирайки отделни етапи от преминаването на митогенния сигнал, репликация, транскрипция и други процеси (това беше обсъдено в редица предишни параграфи и е споменато в някои последващи), то в случай на силен оксидативен стрес неизбежни и негативни последици. Например, някои макромолекули, включително тези, които участват в митогенезата, могат да бъдат модифицирани, които, независимо от теломеразната активност и дължината на теломерите, трябва да инхибират пролиферацията и/или да индуцират някои други нарушения, до и включително клетъчна смърт.
Както и да е, двете причини за стареене на клетките in vitro - натрупване на грешки при условията на тяхното поддържане в културата и скъсяване на теломерите - остават най-вероятни. Смята се, че и в двата случая протеиновите системи p53 и Rb се активират и когато функцията им е нарушена, настъпва клетъчна трансформация (Sherr and DePinho, 2000). По-общо, виждаме следното: при токсични хипероксични условия на култивиране, нормалните клетки, стареене, най-вероятно претърпяват апоптоза на А1, а туморните клетки - на апоптоза на А2. В случай на неизправности в механизма на апоптоза, първите претърпяват неопластична трансформация, докато вторите се подлагат на окислителна цитолиза (вж. раздел 7.1.1).
Допълнителна причина, допринасяща за интензифицирането на процесите на окислително разграждане в клетките in vitro, може да се счита и топлината, като постоянно действащ фактор. заобикаляща среда. Действително, използвайки високочувствителен метод (описан от авторите на Bruskov et al., 2001), беше показано, че ROS се генерират във водни разтвори под действието на топлина. В резултат на термично активиране на атмосферния O2, разтворен във вода, възниква последователност от реакции
O2 → 1O2 → O → HO2˙ → H2O2 → OH˙.
Образуваните ROS, очевидно, допринасят за термичното увреждане на ДНК и други биологични молекули чрез тяхното "автоксидиране".
И накрая, ние отбелязваме друг начин за интензифициране на процеса на стареене на клетките при условия in vitro с помощта на процедурата на аноксия-реоксигенация, резултатите от която според нас най-ясно отразяват същността на кислородно-пероксидния модел на стареене. Механизмът на стареене в този случай се основава на два фундаментални ефекта: адаптивно намаляване (отслабване) на митохондриалната база по време на аноксия или хипоксия (виж по-горе); значително увеличаване на липидната пероксидация и други процеси на окислително разрушаване по време на последваща реоксигенация поради рязко повишаване на pO2 (спрямо състоянието на аноксия) и невъзможността за бързо използване на излишния O2 от "аноксични" митохондрии. Степента на пероксидативен стрес и следователно скоростта на стареене на клетките ще зависят от продължителността на престоя им в състояние на аноксия: колкото по-дълъг е този период, толкова по-добре митохондриалната база ще може да се адаптира към ниско ниво на pO2 и толкова по-значително ще бъде увреждането на клетките след елиминиране на исхемията.
Следният факт може да послужи като пример за осъществяване на клетъчно стареене по посочения „сценарий”. Хепатоцити, изолирани от плъхове различни възрасти, бяха подложени на 2-часова аноксия и 1-часова реоксигенация. Установено е, че във фазата на реоксигенация хепатоцитите произвеждат голямо количество кислородни радикали, отговорни за увреждането на техните мембрани и други структурни и функционални промени, свързани със стареенето, а старите клетки са по-чувствителни към реперфузионно увреждане (Gasbarrini et al., 1998 ). Подобни факти са разгледани от нас в глава 4 във връзка с обсъждането на механизма на стареене и „спонтанното“ злокачествено заболяване на клетките в културата.

За експерименти in vitro е използвана цяла кръв на 11 клинично здрави доброволци и 36 пациенти с термично нараняване.

2.3. Изследователски методи

2.3.1. Имунологични методи за изследване

2.3.1.1. Оценка на спонтанна и индуцирана секреторна активност на мононуклеарни клетки от периферна кръв in vitro

Обект на изследването е венозна кръв, взета от здрави доброволци и от пациенти с термично увреждане сутрин на празен стомах. Кръвта се стабилизира с хепарин със скорост 10 IU/ml. Фракцията от мононуклеарни клетки се изолира съгласно метода при градиент на плътност от 1,077 g/ml чрез центрофугиране (400 g за 45 минути) с използване на ficoll и verografin. За образуване на среда с плътност 1,077 g/cm3 са използвани 9% (w/v) ficoll-400 разтвор (Diam, Москва) и 60% официален урографин (Schering, Германия). Опалесцентният пръстен от мононуклеарни клетки се взема от интерфазата с пипета на Пастьор и се промива три пъти чрез центрофугиране със среда 199 при 689 g за 5-7 минути. Промитите и ресуспендирани клетки се регулират до концентрация от 1 х 107 клетки/ml. Тяхната жизнеспособност се оценява чрез оцветяването им с 0,2% разтвор на трипаново синьо, жизнеспособността е най-малко 98%.

Култивирането на клетките се извършва при 5% въглероден диоксид във въздуха при температура 37°С за 1 час. При стерилни условия съдържанието на клетките се аспирира, последвано от две промивки от неприлепнали клетки с разтвор на Ханк. След това към всяка ямка се добавят 250 μl 10% фетален телешки серум и 80 μg/ml гентамицин. След това клетките се култивират в продължение на 72 часа, в термостат при 5% въглероден диоксид във въздуха, при температура 37 0 С, концентрацията на цитокини се определя в супернатанта.

2.3.1.2. Изследване на вродения имунитет

Определяне на броя на левкоцитите и левкоцитната формула.Броят на левкоцитите в периферната кръв се определя по конвенционалния метод на меланж в камерата на Горяев. Формулата на левкоцитите се изчислява в кръвни намазки, фиксирани с метилов алкохол и оцветени с лазур II-еозин по Romanovsky-Giemsa. Преброени са 200 левкоцита с диференциация на еозинофили, базофили, метамиелоцити, прободни и сегментирани неутрофили, лимфоцити, моноцити. Техният брой се изразява в относителни (%) и абсолютни (10 9 /L) стойности.

Функционалната активност на фагоцитите е изследвана по отношение на NBT-теста и фагоцитозата.

Изследване на абсорбционния капацитет на фагоцитите на периферната кръвбеше проведено върху модел на абсорбция на латексни частици. За да се оцени фагоцитозата, 200 μl кръв се смесва с 20 μl суспензия от частици от монодисперсен (диаметър 1,7 μm) полистиренов латекс. След 60 минути инкубация при температура 37 0 С от суспензията се приготвят препарати, които се сушат, фиксират с метанол и се оцветяват с лазур II - еозин по Romanovsky-Giemsa. Използвана е имерсионна микроскопия, за да се вземе предвид активността на фагоцитозата - % клетки, които са уловили поне една латексна частица, интензитетът на фагоцитозата - броят на абсорбираните латексови микросфери в 100 преброени клетки и фагоцитното число - броят на абсорбирания латекс микросфери на фагоцит.

NST-тесте проведено, като се вземе предвид интензивността на редукция на нитросиния тетразолий (NBT) от фагоцитите в неговата неразтворима форма - диформазан по метода на A.N. Маянски и М.Е. Виксман (1979). Проведен е спонтанен и индуциран NBT-тест.

В епруветки с 0,2 ml кръв се добавят 0,1 ml 0,2% разтвор на стандартен разреден нитросин тетразолий в 0,1 М фосфатен буфер (рН 7,4). За оценка на индуцирания HBT тест, 20 μl от суспензия от частици от монодисперсни (1,7 μm диаметър) частици от полистирол латекс (индуцирана серия) или 20 μl 0,9% NaCl (спонтанна серия) бяха добавени към всяка ямка. След 30-минутна инкубация при температура 37°С към реакционната смес се прибавят 3 ml 0,1% солна киселина, за да се спре реакцията. Епруветките се центрофугират при 1000 rpm за 5 минути. Супернатантата се изхвърля, приготвят се намазки от утайката. След изсушаване препаратите се фиксират с метанол и се оцветяват в продължение на 5 минути с 0,1% воден разтвор на сафранин. Използвайки микроскопия при увеличение 90x10x1,5, ние определихме процента клетки, които възстановяват NBT и интензитета на реакцията според активността на NBT редукция, за която NBT-позитивните клетки бяха разделени на 3 групи:

1 - клетки с гранули диформазан в цитоплазмата с обща площ по-малка от 1/3 от площта на ядрото;

2 - клетки с диформазан гранули в цитоплазмата над 1/3 от площта на ядрото;

3 – клетки с гранули на диформазан, по-големи от ядрото.

За да се получи коефициентът на интензивност на реакцията, броят на клетките в първата група, изразен като процент, се умножава по 1, втората група - по 2, третата - по 3, резултатите се сумират и разделят на 100.