Pri vzdialenej hybridizácii sa používajú také metódy izolovanej tkanivovej kultúry, ako je oplodnenie in vitro, kultivácia embryí (pestovanie izolovaných embryí na umelých živných médiách), klonálna mikropropagácia cenných hybridov, ako aj produkcia haploidov in vitro a kryokonzervácia.

In vitro fertilizácia (prekonanie inkompatibility programu) sa vykonáva v prípade, keď nie je možné vykonať oplodnenie medzi vybranými pármi v prirodzených podmienkach. Je to spôsobené niekoľkými dôvodmi: 1) fyziologickými (rozpor v čase dozrievania peľu a pod.); 2) morfologické (krátka peľová trubica alebo blokovanie jej rastu v rôznych štádiách vývoja atď.). Hnojenie in vitro možno uskutočniť dvoma spôsobmi: a) kultiváciou na umelom agarovom živnom médiu vaječníka s aplikovaným hotovým peľom; b) vaječník sa otvorí a kúsky placenty s vajíčkami sa prenesú do živného média, v blízkosti ktorého alebo priamo na tkanivách placenty sa kultivuje hotový peľ. Je možné vizuálne určiť, či oplodnenie in vitro prešlo alebo nie, rýchlym zvýšením veľkosti vajíčok. Vytvorené embryo spravidla neprejde do kľudového stavu, ale okamžite klíči a dáva vznik hybridnej generácii. Placentárne oplodnenie in vitro umožnilo prekonať inkompatibilitu pri krížení odrôd pestovaného tabaku N. tabacum s divokými druhmi N. rosulata a N. debneyi a umožnilo získať medzidruhové hybridy tabaku v experimentoch MF Ternovského a kol. 1976), Shinkareva (1986).

Prekonanie postgamickej nekompatibility. Po oplodnení dochádza k postgamickej inkompatibilite so vzdialenou hybridizáciou. To často vedie k tvorbe drobných neklíčiacich semien. Dôvodom môže byť nesúlad v čase vývoja embrya a endospermu. V dôsledku slabého vývoja endospermu nie je embryo schopné normálne klíčiť. V takýchto prípadoch sa embryo izoluje zo zrelého drobného zrna a pestuje sa v živnom médiu.

Pestovanie embryí v umelom živnom médiu sa nazýva embryokultúra. Médium na pestovanie zrelého embrya môže byť jednoduché, bez pridania fyziologicky aktívnych látok (napríklad Whiteovo médium) alebo akéhokoľvek iného obsahujúceho minerálne soli a sacharózu. Pri vzdialenejších kríženiach možno pozorovať poruchy vo vývoji embrya už v skorých štádiách, čo sa prejavuje pri absencii diferenciácie, pomalého rastu. V tomto prípade sa kultivácia embrya skladá z dvoch fáz - embryonálneho rastu embrya, počas ktorého pokračuje jeho diferenciácia, a klíčenia vyrasteného embrya. Prvá fáza si vyžaduje zložitejšie médium s vysoký obsah sacharóza, s prísadami rôznych aminokyselín, vitamínov a hormónov.

Využitie embryonálnej kultúry v chove získava v V poslednej dobe veľký význam na získanie vzdialených hybridov obilnín, obilnín a iných poľnohospodárskych plodín. Ukázala sa možnosť zvýšenia úrody hybridov pšenice a raže pestovaním nezrelých embryí, ako aj využitie embryonálnej kultúry na prekonanie postgamickej inkompatibility pri hybridizácii pšenice s roštenkou.

Metóda kultivácie embryí sa čoraz viac využíva pri medzidruhovej hybridizácii zeleninových rastlín. Pre cibuľu boli vyvinuté techniky na pestovanie in vitro abortívnych embryí z hybridných semien z rôznych štádií embryogenézy, pričom embryá rastú z čiastočne fertilných medzidruhových hybridov. Kultúra izolovaných embryí sa používa pri šľachtení paradajok a iných zeleninových rastlín.

Bola študovaná hormonálna regulácia rastu a vývoja embryí paradajok in vitro. Diskutuje sa o možnosti použitia embryonálnej kultúry na získanie vzdialených hybridov slnečnice a študujú sa faktory regulujúce rast a vývoj slnečnicových embryí izolovaných v rôznych časoch po opelení in vitro.

Kultivácia izolovaných embryí ako pomocná metóda pre vzdialenú hybridizáciu sa používa nielen na prekonanie postgamickej inkompatibility, ale aj na mikropropagáciu cenných hybridov. V tomto prípade mikropropagácia prebieha kaluzogenézou, indukciou morfogenézy a produkciou regenerovaných rastlín z kalusového tkaniva. Technika klonovania nezrelých embryí umožňuje množenie cenných rastlinných genotypov v ranom štádiu životný cyklus. Ďalšou možnosťou využitia kultúry embryí je jej využitie pri bunkovej selekcii.

Klonálna mikropropagácia vzdialených hybridov. Embryokultúra umožňuje pestovať hybridné rastliny z defektných embryí. Výnos hybridných rastlín je však nízky a hybridy sú často sterilné. Niekedy, napríklad pri šľachtení pohánky, je ťažké reprodukovať jedinečné genotypy v potomstve kvôli krížovému opeleniu plodiny. Preto výskumníci často stoja pred úlohou rozmnožiť a zachovať výsledné rastliny. Pomáha v tom metóda klonálnej mikropropagácie. Hybridy sa rozmnožujú aktiváciou vývinu axilárneho púčika meristémom (odrezkami sterilných výhonkov), adventívnymi púčikmi alebo regeneráciou rastlín z kalusového tkaniva, najmä získaného kultiváciou embryí.

Získavanie haploidov in vitro a ich využitie v chove.Úloha haploidných rastlín v chove je veľmi veľká. Ich použitie vám umožňuje rýchlo nájsť správnu kombináciu, skracuje čas na vytvorenie odrody. Haploidy sa používajú na získanie stabilných homozygotných línií. Na mutagenézu je tiež vhodnejšie použiť haploidy, pretože výber recesívnych mutácií je uľahčený na haploidnej úrovni.

V diploidných rastlinách mutácie zriedka ovplyvňujú oba alelické gény na homológnych chromozómoch. Jedinec je zvyčajne heterozygot (dva gény sú odlišné) a ovplyvnený je iba dominantný (ale nie recesívny) gén. Keďže mutácie sú častejšie recesívne ako dominantné, je dosť ťažké ich identifikovať. V haploidných rastlinách, ktoré obsahujú iba jeden z každého páru homológnych chromozómov, sa mutácie objavia okamžite. Selekcia na haploidnej úrovni umožňuje priamy výber nielen dominantných, ale aj recesívnych znakov.

Haploidné jedince sú sterilné, ale je možné umelo zdvojnásobiť ich chromozómovú sadu kolchicínom a získať diploidné homozygotné rastliny.

Haploidy môžu vzniknúť spontánne, ale frekvencia ich spontánneho výskytu je veľmi nízka. Umelo pomocou metód in vitro je možné získať veľké množstvo haploidných rastlín. Existujú tri spôsoby, ako získať haploidy pomocou metódy izolovanej tkanivovej kultúry:

androgenéza – získavanie haploidných rastlín na umelom živnom médiu z izolovaných prašníkov a mikrospór.

gynogenéza - získavanie haploidných rastlín na umelom živnom médiu z izolovaných vajíčok;

partenogenéza – získavanie haploidov z hybridného embrya, pri ktorom v dôsledku inkompatibility chromozómov rodičov dochádza k strate otcovských chromozómov.

Haploidné embryoidy vytvorené ako výsledok eliminácie chromozómov otcovského genómu sa kultivujú na umelých živných médiách a získajú sa haploidné rastliny. Odrody jačmeňa Istok a Odessa-15 boli získané kombináciou partenogenetickej metódy s kultiváciou izolovaných embryí za štyri roky namiesto zvyčajných 10–12 rokov. Viac ako 2,5 tisíc dihaploidných línií, ktoré sa vyznačujú homogenitou a stabilitou, bolo získaných metódou prašníkovej kultúry z odrôd a hybridov mäkkej a tvrdej pšenice v NPO Elita Povolzhya počas štyroch rokov.

Pokračuje vývoj technológie získavania haploidov prostredníctvom kultúry prašníkov pšenice, jačmeňa, kukurice, ozimnej raže a zemiakov. V kultúre prašníkov sú možné dva spôsoby tvorby haploidných rastlín. Prvým je tvorba rastlín embryogenézou v peľových zrnách. Zároveň z jednotlivých peľových zŕn vo vnútri prašníkov vznikajú embryoidy. Klíčia a produkujú haploidné rastliny. Druhým je tvorba kalusu z buniek prašníka. Následne v dôsledku morfogenézy dochádza k regenerácii rastlín z buniek kalusu. V tomto prípade nie sú výsledné rastliny vždy haploidné a často sa líšia v ploidii. Nie je úplne jasné, či sú tvorené z polyploidizovaných haploidných buniek alebo z fúzovaných buniek.

Haploidy získané in vitro možno využiť nielen pri praktickej selekcii, ale aj v genetickom inžinierstve a bunkovej selekcii. Peľové zrná sú v niektorých prípadoch vhodnejšími objektmi ako protoplasty na experimenty s genetickou transformáciou.

Kryokonzervácia rastlín

Kryokonzervácia somatických buniek rastlín v tekutom dusíku (teplota - 196°C) je nový smer v biotechnológii, ktorý sa vo veľkej miere rozvíja od začiatku 70. rokov 20. storočia. Účelom tejto technológie je zachovať genofond v kultúre in vitro, ako aj poskytnúť chovateľom kedykoľvek genotyp, ktorý má požadované vlastnosti: potrebný peľ na hybridizáciu; jedinečné a jednotlivé semená, vrátane tých, ktoré neznesú dehydratáciu; transformované, mutantné, hybridné bunky odlišné typy rastliny schopné in vitro morfogenézy; zygotické a somatické embryá atď. V súčasnosti boli vyvinuté podmienky kryoprezervácie pre kultivované bunky viac ako 30 druhov, kalusové kultúry (asi 10 druhov), izolované protoplasty (8 druhov), konzerváciu meristémov (25 druhov) a špičiek stoniek (13 druhov). Prioritu v tomto smere má Ústav fyziológie rastlín Ruskej akadémie vied a najmä Oddelenie tkanivovej kultúry a morfogenézy pod vedením prof. R. G. Butenko.

Pri vykonávaní prác na kryoprezervácii je potrebné v prvom rade brať do úvahy špecifiká rastlinných buniek: vybrať malé bunky s malou vakuolou a nízkym obsahom vody; vyvinúť prístupy na zmrazenie a následné rozmrazenie rastlinných buniek v každom jednotlivom prípade. Pri kryokonzervácii sa stretávame s množstvom ťažkostí, z ktorých jedna je spojená s ochranou zmrazených buniek a tkanív pred osmotickým stresom a mechanickou deštrukciou štruktúr v dôsledku tvorby a rastu ľadových kryštálikov vo vnútri bunky. Zároveň je potrebné správne vybrať podmienky, ktoré zabezpečia vysoké prežitie buniek pri rozmrazovaní a rekultivácii.

Napriek rôznorodosti prác v tomto smere načrtli bežné techniky kryokonzervácie: ošetrenie buniek pred zmrazením, použitie kryoprotektantov, dodržiavanie určitého režimu mrazenia v rozmedzí od 0 do –40 °C (v ojedinelých prípadoch až do -70°C). C), ako aj špeciálne opatrenia na rozmrazovanie predmetov.

Proces kryokonzervácie spravidla začína prípravou bunkovej kultúry na zmrazenie. Dá sa to dosiahnuť niekoľkými spôsobmi, medzi ktoré patrí kultivácia buniek na živných médiách obsahujúcich rôzne osmoticky aktívne látky: manitol alebo sorbitol v koncentrácii 2–6 %, aminokyseliny a medzi nimi predovšetkým prolín, ktorého význam pre Väzba vody v rastlinných bunkách je široko známa, rovnako ako kyselina y-aminomaslová.

Výber kryoprotektantov, látok, ktoré znižujú poškodenie buniek osmotickým a mechanickým stresom, prebieha empiricky podľa princípu najmenšej toxicity a optimálneho účinku. Spomedzi všetkých známych kryoprotektantov sú také látky, ktoré ľahko prenikajú do buniek, ako je dimetylsulfoxid (DMSO, 5–10 %), glycerol (10–20 %), ako aj nepenetrujúci vysokomolekulárny polyvinylpyrolidón (PVP), dextrán, polyetylénglykol (PEG) s molekulovou hmotnosťou 6000.

Veľký význam pri kryoprezervácii má správne zvolený režim mrazenia od 0 do –40 °C. Spravidla je pre všetky predmety nastavená rýchlosť mrazenia 0,5 – 1 °C za minútu a všetky tieto práce sa vykonávajú na špeciálnom zariadení. ktorý zabezpečuje zmrazenie softvéru. Takéto zariadenia vyrába špeciálna konštrukčná technologická kancelária s pilotnou výrobou v Ústave pre problémy kryobiológie a kryomedicíny (Charkov).

Pomalé zmrazovanie a použitie kryoprotektantov teda umožňuje oslobodiť bunku od voľnej vody a pri teplote –40 °C sa bunky úplne dehydrujú, čo umožňuje ďalšie zmrazovanie, konkrétne ponorenie ampuliek do rastlinného materiálu. v tekutom dusíku.

Skladovanie materiálu v tekutom dusíku je prakticky neobmedzené. Napríklad v kryobanke Ústavu fyziológie rastlín Ruskej akadémie vied sa bunky mrkvy uchovávajú v tekutom dusíku asi 20 rokov, meristémy zemiakov viac ako 10 rokov atď.

Rozmrazovanie a testovanie životaschopnosti buniek po skladovaní v tekutom dusíku je posledným krokom v technológii kryokonzervácie. Ak sa zmrazovanie vykonáva pomaly, postupne, rozmrazovanie by sa malo vykonať čo najrýchlejšie. Na tento účel sa ampulky umiestnia do vodného kúpeľa s teplotou 40 ° C a niekedy aj 60 ° C a uchovávajú sa, kým úplne nezmizne posledný ľadový kryštál.

Na stanovenie životaschopnosti buniek po rozmrazení sa používa najjednoduchšia, najrýchlejšia a celkom uspokojivá metóda - farbenie životne dôležitým farbivom (0,1% fenosafranín alebo 0,25% roztok Evansovej modrej), v dôsledku čoho sú zafarbené mŕtve bunky, ale živé. niesu. Posledným kritériom je samozrejme jasné obnovenie rastu a delenia buniek počas regenerácie na umelých živných pôdach po rozmrazení.

Experimentálne sa ukázalo, že po uskladnení v tekutom dusíku bunky nestrácajú schopnosť deliť sa, regenerovať rastliny, neznižuje sa produktivita syntézy sekundárnych metabolitov (produkčných buniek) atď. Ústav fyziológie rastlín Ruskej akadémie vied teda spolu s NPO pre pestovanie zemiakov vyvinul metódy na kryokonzerváciu meristémov štyroch odrôd zemiakov a ukázal možnosť regenerácie celých rastlín z 20 % skladovaných meristémov, ktoré keď boli vysadené na poli, nelíšili sa vo všetkých charakteristikách, vrátane rýchlosti rastu a produktivity, od bežných rastlín v skúmavke (S. Manzhulin a kol., 1982). Viac podrobností o technike kryokonzervácie možno nájsť v prehľadových prácach A. S. Popova.

Technológia spojená s kryokonzerváciou rastlinných objektov sa teda vyvíja a neustále zlepšuje. Táto technológia má nepochybne svoju budúcnosť, keďže aj dnes môžu kryobanky výrazne uľahčiť prácu šľachtiteľom, pričom majú možnosť širokého využitia genofondu odrôd, vrátane starých výberových a divokých druhov, ako aj ohrozených druhov rastlín.



V. V. Rogovaya, M. A. Gvozdev

ZNAKY MIKROKLOLNEJ REPRODUKCIE KAMENINY ZA IN VITRO PODMIENOK

Článok predstavuje prehľad, ktorý pojednáva o vlastnostiach metód mikropropagácie plodín kôstkového ovocia v systéme in vitro. Osobitná pozornosť sa venuje spôsobu rozmnožovania pazušnými púčikmi a spôsobu regenerácie náhodných výhonkov z listových explantátov čerešní, čerešní, broskýň a marhúľ. Zvažuje sa problematika ozdravovania rastlín od rôznych patogénov a testovania rastlinného materiálu porastov kôstkového ovocia na prítomnosť vírusových infekcií.

Prvýkrát mikropropagáciu vykonal francúzsky vedec Georges Morel na orchideách v 50. rokoch dvadsiateho storočia. Vo svojich dielach využíval techniku ​​pestovania vrcholového meristému rastlín. Takto získané rastliny boli bez vírusovej infekcie.

U nás sa výskum zušľachťovania rastlín meristémovou metódou a klonálnou mikropropagáciou začal v 60. rokoch na Ústave fyziológie rastlín. Akadémia vied K. A. Timiryazeva ZSSR.

Mikroklonálne rozmnožovanie – získavanie rastlín in vitro, ktoré sú geneticky identické s pôvodným explantátom (metóda vegetatívneho rozmnožovania rastlín v kultúre in vitro). Mikropropagácia je založená na jedinečnej vlastnosti somatickej rastlinnej bunky - totipotencii - schopnosti buniek plne realizovať genetický potenciál celého organizmu.

V súčasnosti sú čoraz dôležitejšie rôzne metódy mikroklonálneho rozmnožovania poľnohospodárskych plodín (predovšetkým vegetatívne rozmnožovaných) v systéme in vitro: rozmnožovanie axilárnymi a adventívnymi púčikmi, nepriama morfogenéza, somatická embryogenéza.

Pomocou týchto metód je možné:

urýchliť proces výberu, v dôsledku čoho sa termíny získania obchodovateľných produktov skrátia na 2 až 3 roky namiesto 10 až 12;

Prijať v krátkom čase veľké množstvo zdravého materiálu bez vírusov, geneticky identického s materskou rastlinou;

Pracovať v laboratórnych podmienkach a podporovať aktívne rastúce rastliny po celý rok;

Rozmnožovať rastliny prakticky bez kontaktu s vonkajším prostredím, čím sa eliminuje vplyv nepriaznivých abiotických a biotických faktorov;

Získajte maximálny počet rastlín na jednotku plochy;

V krátkom čase získať veľké množstvo rastlín, ktoré sa ťažko množia alebo sa vegetatívne nerozmnožujú;

Pri pestovaní rastlín s dlhou juvenilnou fázou je možné urýchliť prechod z juvenilnej do reprodukčnej fázy vývoja;

Po dlhú dobu (do 1-3 rokov), aby sa rastlinný materiál uchoval v podmienkach in vitro (bez pasážovania na čerstvom médiu),

Vytvárať banky na dlhodobé uchovávanie cenných foriem rastlín a ich jednotlivých orgánov;

Vyvinúť metódy na kryokonzerváciu in vitro dezinfikovaného materiálu.

Etapy mikropropagácie plodín kôstkového ovocia a testovanie na prítomnosť vírusových infekcií

Proces mikropropagácie zahŕňa niekoľko fáz. Hlavné sú:

1. etapa - zavedenie explantátu do kultúry in vitro;

2. etapa - mikropropagácia;

3. etapa - proces zakorenenia mikrovýhonov;

4. etapa - realizácia výstupu zakorenených rastlín zo sterilných podmienok do nesterilných.

Dôležitým krokom v mikropropagácii rastlín in vitro je pestovanie bezvírusových materských foriem rastlín v pestovateľských domoch alebo izolovaných boxoch v zimných skleníkoch, v podmienkach neprístupných pre prenášačov vírusov. Explantátové darcovské rastliny na následné zavedenie do in vitro kultúry by sa mali testovať na prítomnosť vírusových, mykoplazmatických a bakteriálnych infekcií pomocou diagnostických metód PCR, buď molekulárnej hybridizácie alebo enzýmovej imunoanalýzy (ELISA).

Metóda ELISA umožňuje v krátkom čase odhaliť prevažnú väčšinu vírusov, ktoré infikujú plodiny kôstkového ovocia: vírus zakrpatenosti slivky, vírus nekrotickej prstencovej škvrnitosti kôstkovín, potyvírus slivky šarkany, nepovírusy kučeravosti listov čerešní. Klony, u ktorých sa pomocou ELISA zistilo, že neobsahujú kontaktné vírusy, sa potom podrobia základnému testovaniu, ktoré zahŕňa sérologické testy v kombinácii s testom na indikátorových rastlinách. Rastliny, u ktorých sa podľa výsledkov testovania zistilo, že neobsahujú vírusy a iné regulované patogény, sú zaradené do kategórie základných klonov „bez vírusov“. Ak sa zistí infekcia, pôvodné rastliny možno asanovať. Na obnovu kôstkovín od vírusov je najvhodnejšie kombinovať metódy suchovzdušnej termoterapie a in vitro kultivácie. Ak sa kultúra izolovaných apikálnych meristémov nedokáže zbaviť testovaných vírusov, používajú sa metódy chemoterapie založené na zavádzaní chemikálií do živných médií, ktoré in vitro inhibujú rozvoj vírusovej infekcie v rastlinách.

Niekedy, aby sa aktívne identifikovala bakteriálna mikroflóra, sú médiá obohatené o rôzne organické prísady, napríklad kazeínový hydrolyzát, ktorý vyvoláva vývoj saprofytických mikroorganizmov. Infekcia sa hodnotí vizuálne po 7-10 dňoch. "Čisté" explantáty sa umiestnia na živné pôdy na ďalšiu kultiváciu. Cvičenie v tejto fáze a používanie prostredí bez rastových látok.

Úvod do kultivácie a mikropropagácie kôstkovín in vitro

Pri klonálnej mikropropagácii plodín ovocných kôstkovín sa ako zdroj explantátov zvyčajne používajú apikálne a laterálne púčiky, ako aj meristematické vrcholy. Izolácia apikálneho meristému sa uskutočňuje podľa všeobecne uznávaných metód po postupnej sterilizácii rastlinného materiálu.

Na mikromnoženie porastov kôstkového ovocia sa používajú rôzne médiá: na mikromnoženie čerešní - Pierik, Gautre, White, Heller médium, pre čerešne a slivky - Rosenbergovo médium upravené pre ovocné plodiny a pre slivky - Lepoyvre a B5 médium. Na mikromnoženie čerešní, čerešní a sliviek je však najvhodnejšie médium Murashige-Skoog (MS).

V závislosti od štádia mikroklonálneho rozmnožovania plodín ovocných kôstkovín sa 6-benzylaminopurín (6-BAP) pridáva do živných médií v koncentráciách 0,2-2 mg/l. V štádiu zavádzania do in vitro kultúry sa používa nižšia koncentrácia cytokinínu – 0,2 mg/l BAP. Na vyvolanie proliferácie axilárnych pukov s cieľom získať maximálny počet výhonkov sa mikrorastliny čerešní pestujú s prídavkom BAP v koncentráciách 0,5-2 mg/l, mikrorastliny slivky 0,5-1 mg/l BAP.

Proces zakoreňovania mikrovýhonov

Fáza zakorenenia si vyžaduje osobitnú pozornosť. Proces zakoreňovania výhonkov kôstkovín in vitro závisí od odrodových vlastností, od počtu vykonaných pasáží, od koncentrácie a typu auxínu a od spôsobu jeho aplikácie. Na získanie plne formovaných mikrorastlín plodín kôstkového ovocia sa z média vylúči 6-BAP, ktorý zabraňuje procesom rizogenézy, a do média sa zavedú auxíny, najmä kyselina β-indolyl-3-maslová (IMA). Zistilo sa, že optimálna koncentrácia IMC v zložení živného média je v rozsahu 0,5-1 mg/l. Prítomnosť IMC v médiu v koncentrácii 2 mg/l spôsobuje tvorbu hypertrofovaných koreňov.

Spoločné zavedenie prípravku ribav (1 ml/l) a tradičných fytohormónov auxínov [IMA a kyselina β-indoloctová (IAA) po 0,5 mg/l] do média na zakorenenie zvyšuje percento zakoreňujúcich výhonkov mnohých odrôd plodín kôstkového ovocia.

V porovnávacej štúdii induktorov tvorby koreňov: IAA, IAA a kyseliny α-naftyloctovej (NAA) bola zistená vysoká účinnosť IAA v koncentrácii 6,0 mg/l. Najväčší počet zakorenených čerešňových mikrorezkov sa získal na médiu obsahujúcom NAA. Zároveň však došlo k intenzívnemu rastu kalusu na bazálnej ploche výhonkov, čo sťažovalo prenos rastlín v skúmavke s koreňmi do nesterilných podmienok.

Pre efektívne zakorenenie skúmaviek kôstkovín má veľký význam nielen druh stimulantu, ale aj spôsob jeho aplikácie. Okrem zavedenia auxínov do živného média sa na vyvolanie rizogenézy používa predbežné namočenie výhonkov v sterilnom vodnom roztoku IBA (25-30) mg/l pri expozícii 12-24 hodín. Vykonané experimenty ukázali, že ošetrenie mikrorezkov vodným roztokom IBA je účinnejšie ako zavedenie tohto regulátora do kultivačného média. Hromadný výskyt prvých náhodných koreňov s použitím predbežného ošetrenia induktorom rizogenézy bol zaznamenaný na 20. až 25. deň. Ďalším spôsobom, ako vyvolať rizogenézu, je ošetrenie výhonkov plodín kôstkového ovocia práškom IMC obsahujúcim mastenec auxín s koncentráciou 0,125 %, 0,25 % a IAA s koncentráciou 0,25 %, 0,5 %. Pri použití hormonálneho prášku bola zaznamenaná vysoká účinnosť a vyrobiteľnosť použitia induktorov rizogenézy. Použitie mastenca IMC s rôznymi koncentráciami auxínu však odhalilo odrodovú špecifickosť pri zakorenení mikrorezkov sliviek.

Proces rizogenézy prebieha najintenzívnejšie na modifikovaných MS a bielych médiách. Podľa iných zdrojov sú na tvorbu koreňov najlepším médiom makroživiny Heller s pridanými vitamínmi a poloriedené MS médium so zníženým obsahom sacharózy 15 mg/l a s výnimkou mezoinozitolu, ktorý podporuje tvorbu kalusového tkaniva. Vo väčšine prác sa však na zakorenenie mikrovýhonov plodín kôstkového ovocia používajú médiá Murashige a Skoog.

Metódy mikropropagácie

Existuje niekoľko spôsobov, ako mikropropagovať rastliny in vitro:

Spôsoby reprodukcie axilárnymi púčikmi;

Spôsoby rozmnožovania náhodnými púčikmi;

Nepriama morfogenéza;

somatickej embryogenéze.

Pre každý typ regenerácie in vitro možno rozlíšiť štyri skupiny faktorov, ktoré určujú jej úspešnosť: genotyp a stav pôvodnej rodičovskej rastliny; podmienky a spôsoby pestovania; zloženie živných médií; vlastnosti zavedenia explantátu do sterilnej kultúry.

Vplyv genotypu na účinnosť mikropropagácie

Najvýraznejší vplyv na účinnosť mikropropagácie má genotyp. Reakcia rastlín na podmienky aseptického pestovania závisí od odrodových vlastností a vysvetľuje sa odlišnou regeneračnou schopnosťou odrôd ovocných a bobuľových plodín. Napríklad pri použití klonálnej mikropropagácie na rýchle rozmnožovanie nových kultivarov čerešní sa zistilo, že odrodové znaky sú dominantnými faktormi v schopnosti rastlín mikropropagovať sa.

Odrodové rozdiely sa prejavili tak v štádiu premnoženia, ako aj v štádiu tvorby koreňov.

Medzi explantátmi rôznych odrôd toho istého druhu ovocných drevín je často rôzny stupeň prejavu reakcie na rastové regulátory obsiahnuté v médiu, čo zrejme do určitej miery odráža endogénny obsah rastových látok, ktorý je geneticky podmienená vlastnosť druhu alebo odrody. Zároveň realizácia morfogenetického potenciálu v kultúre embryí in vitro, u hybridov medzi druhmi Cerasus vulgaris, C. maackii, C. fruticosa, Padus racemosa, bola determinovaná najmä genotypom a v menšej miere aj genotypom. záviselo od zloženia živnej pôdy.

Podmienky pestovania

Ďalším faktorom podmieňujúcim úspešnosť mikropropagácie rastlín sú podmienky ich pestovania. Optimálne podmienky pestovanie plodín kôstkového ovocia sú: teplota 22-26°C pre čerešne, čerešne a 26-28°C - pre slivky, osvetlenie 2000-5000 lux - pre čerešne a čerešne a 3500 lux pre slivky so 16-hodinovou fotoperiódou. Mikrorastliny by sa mali pestovať v klimatických komorách alebo kontrolovaných miestnostiach.

Treba poznamenať, že u odrôd višní v štádiu premnoženia môže zvýšenie multiplikačného faktora a zvýšenie podielu výhonkov vhodných na zakorenenie zabezpečiť príjem striedania. minerálne kompozície kultivačné médiá a používanie lámp s modrým svetlom (LP 1) . Pri horizontálnej orientácii regenerantov možno vytvoriť veľké množstvo výhonkov plodín kôstkového ovocia - až 30. Aby sa zvýšil multiplikačný faktor v prvých pasážach, konglomeráty púčikov a výhonkov plodín kôstkového ovocia nemožno rozdeliť na samostatné jednotky, ale úplne preniesť do čerstvého živného média. Pri použití tejto techniky hodnota multiplikačného faktora prudko stúpa a môže dosiahnuť 40-70 na pasáž v závislosti od odrody.

Spôsob množenia axilárnymi púčikmi nepriama morfogenéza

Najspoľahlivejšou metódou mikropropagácie je metóda regenerácie rastlín vývojom axilárnych pukov. Výhodou tejto metódy je pomerne rýchla reprodukcia pôvodného genotypu pri zabezpečení najvyššej fenotypovej a genotypovej stability. Potenciál tejto in vitro mikropropagačnej metódy sa realizuje pridaním cytokinínov do živných médií, ktoré inhibujú vývoj apikálneho púčika stonky a stimulujú tvorbu axilárnych púčikov.

Proces mikroklonálneho rozmnožovania višní kultúrou izolovaných vrcholových meristémov je založený na fenoméne odstránenia vrcholovej dominancie, čo prispieva k následnému rozvoju už existujúcich meristémov a zabezpečuje genetickú homogenitu sadbového materiálu.

riál. Odstránenie apikálnej dominancie sa dosiahne pridaním cytokinínov. Mnohé kultivary čerešní sa vyznačujú vysokou mitotickou aktivitou vrcholu, ktorá prispieva k tvorbe rozvetveného konglomerátu púčikov a bočných mikrovýhonov.

Genetická stabilita materiálu získaného in vitro závisí od reprodukčného modelu. Proces rozmnožovania ovocia rastliny kôstkového ovocia spojené s proliferáciou axilárnych meristémov. Genetická stabilita je inherentnou vlastnosťou meristému, ktorá sa môže zachovať in vitro, ak sa meristém kultivuje za podmienok, ktoré inhibujú tvorbu kalusu. Ak sa použijú médiá, ktoré stimulujú tvorbu kalusu, potom môže dôjsť k genetickej variabilite.

Pre získanie vyšších multiplikačných faktorov sú živné pôdy často obohatené okrem cytokinínových prípravkov aj látkami zo skupiny auxínov, ktoré stimulujú vývoj kalusového tkaniva. Kombinácie týchto dvoch liečiv sa používajú na vyvolanie organogenézy v tkanivách kalusu. V systéme kalus-výhonky môže organizovaná štruktúra výhonku ovplyvňovať procesy organogenézy, stimulovať meristematizáciu buniek kalusu, čo môže viesť k vzniku orgánov so zmenenými vlastnosťami. Jednoduchá zmena obsahu rastových regulátorov pridaných do živného média na dosiahnutie maximálnej proliferácie buniek môže ovplyvniť genetickú stabilitu výsledného materiálu.

Spôsob rozmnožovania adventívnymi púčikmi a nepriama morfogenéza

Náhodné púčiky sa nazývajú púčiky, ktoré vznikli priamo z tkanív a buniek rastlinných explantátov, zvyčajne ich netvoria. Adventívne (alebo adnexálne) púčiky sa tvoria z meristémových zón, najčastejšie sekundárne vytvorených z kalusových pletív. Náhodné púčiky môžu vzniknúť z meristémových a nemeristémových pletív (listy, stonky). Tvorba náhodných púčikov u mnohých druhov rastlín je vyvolaná vysokým pomerom cytokinínov k auxínom v živnom médiu.

Regenerácia výhonkov, koreňov alebo embryoidov zo somatických rastlinných buniek explantátu môže nastať prostredníctvom nepriamej regenerácie – tvorby kalusu a tvorby výhonkov, alebo prostredníctvom „priamej“ regenerácie, kedy sa bunky explantátu stanú schopné regenerácie bez tvorby kalusových pletív.

Adventívne výhonky sa môžu vytvárať na explantátoch listov, stopiek, koreňov a iných rastlinných orgánov rôznych druhov kôstkovín a ovocných plodín. Získavanie výhonkov priamo z explantátov sa v niektorých prípadoch používa na klonovanie rastlín, ale v tomto prípade sa môžu objaviť geneticky nestabilné rastliny. Preto sa tento spôsob regenerácie rastlín môže použiť na vyvolanie geneticky rôznorodých rastlín.

Regeneračné výhonky možno vyvolať z rôznych častí čepele listu, ale najväčšiu schopnosť regenerácie majú pletivá.

spodnej časti listu, keďže v tejto zóne listovej čepele sa nachádzajú najaktívnejšie meristematické bunky. Treba tiež vziať do úvahy, že morfogenetický potenciál listov sa zvyšuje, keď sú umiestnené smerom k vrcholu stonky. Náhodné výhonky sa lepšie regenerujú z mladého meristematického pletiva vyvíjajúcich sa listov. Pri použití starších listov je však oveľa pravdepodobnejší výskyt geneticky modifikovaných výhonkov.

Na regeneráciu výhonkov plodín kôstkového ovocia, ako je čerešňa, čerešňa, broskyňa, marhuľa, z pôvodných explantátov (celé listy a ich segmenty) sa používajú rôzne médiá: Murashige-Skoog (MB), Lloyd a Mac Cone ( WPM), Driver a Kuniyuki (DKW), Kuren a Lepuavr (QL) .

Na pokusy náhodnej regenerácie čerešní a čerešní sa najčastejšie používa médium Lloyd a McCone's na dreviny Woody Plant Medium (WPM) doplnené o rôzne rastové stimulanty. Z cytokinínov sa používa najmä 6-BAP, thidiazuron (TDZ), z auxínov - NAA, IMC, kyselina 2,4-dichlórfenoxyoctová (2,4-D).

Je dôležité poznamenať, že medzi zahraničnými výskumníkmi neexistuje konsenzus o účinnosti použitia TDZ pri regenerácii výhonkov v porovnaní s BAP, o type explantátu (celé listy, s priečnymi rezmi aplikovanými na ne alebo segmentované) a o spôsobe kultivácie explantáty (abaxiálna alebo adaxiálna plocha).nahor).

Vysoké percento regenerácie bolo pozorované v celých listových explantátoch čerešne (s priečnymi rezmi pozdĺž centrálnej žilky listu), ktoré boli umiestnené abaxiálnym (spodným) povrchom nahor na médium WPM doplnené 2,27 alebo 4,54 |M TDZ + 0,27 | M NUK.

Na druhej strane práca ukazuje, že BAP je účinnejší ako TDZ pri regenerácii rastlín z listov čerešní a čerešní a že BAP a NAA v koncentrácii 2 mg/l a 1 mg/l sú optimálnou kombináciou regulátory rastu rastlín čerešní a čerešní. Najvyššia frekvencia regenerácie bola získaná na médiu WPM, hoci stimulovalo kaluzogenézu viac ako MS, QL, DKW. Bola odhalená závislosť účinnosti tvorby kalusu od typu listových segmentov. Najvyššia miera tvorby kalusu bola teda zaznamenaná v segmentoch stredných listov; najnižšie hodnoty boli na apikálnych segmentoch a priama regenerácia (bez tvorby kalusu) bola zaznamenaná na bazálnych segmentoch.

Adventná regenerácia čerešne čiernej (Prunus serótina Ehrh.) sa vyskytla častejšie, keď sa explantáty listov kultivovali na médiu WPM doplnenom o TDZ v porovnaní s modifikovaným médiom DKW.

Efektívnosť náhodnej regenerácie planých čerešní (Prunus avium L.) bola výrazne ovplyvnená veľkosťou explantátu. Výsledky ukázali, že veľkosť listového explantátu je rozhodujúca pre tvorbu náhodných výhonkov, listy dlhé 3-5 mm tvorili najväčší počet náhodných výhonkov. Na náhodnú regeneráciu divých čerešní sa použil WPM doplnený 0,54 tM NAA a 4,4 tM TDZ.

Špeciálne predkultivačné predpestovanie (namáčanie 5 mg/l 2,4-D na jeden deň) bolo účinné pri vyvolaní náhodných výhonkov z explantátov listov čerešne. Následná kultivácia listových explantátov na regeneračnom agarovom médiu WP doplnenom 5 mg/l TDZ zvýšila účinnosť náhodnej regenerácie čerešní. Mladé listové explantáty čerešní vykazovali vyššiu schopnosť regenerácie ako staré.

Treba poznamenať významný vplyv inhibítorov etylénu na náhodnú regeneráciu listov rôznych odrôd marhúľ. V práci sa napríklad ukázalo, že použitie inhibítorov etylénu (tiosíran strieborný alebo aminoetoxyvinylglycín) spolu s nízkym obsahom kanamycínu zvyšuje náhodnú regeneráciu o viac ako 200 %. Použitie čistého agaru tiež zlepšilo regeneráciu z marhuľových listov v porovnaní s použitím agarového gélu alebo agarózy. V tejto práci boli vykonané štúdie na médiách LQ, DKW doplnených o TDZ a NUK. Spôsob pestovania listov - adaxiálna plocha k okoliu.

Talianski vedci vyvinuli metódu náhodnej regenerácie z celých listov broskyne, ktoré boli inkubované v tme na médiu doplnenom 6-BAP a NAA. V štúdiách boli použité kombinácie makrosolí a mikrosolí rôznych médií podľa MS, Quoirin, Rugini a Muganu, oba cytokiníny - 6-BAP a TDZ, ako aj spôsob kultivácie listov - adaxiálny povrch v kontakte s regeneračným médiom. Kalus vyvinutý na báze listových stopiek. Po prenesení do média bez auxínu a kultivácii na svetle sa na tomto kaluse objavili náhodné výhonky. Morfogenetická schopnosť kalusu bola zachovaná niekoľko mesiacov. V týchto štúdiách sa náhodné výhonky broskýň objavili nepriamou morfogenézou.

Nepriama morfogenéza zahŕňa sekundárnu diferenciáciu obličiek od tkanív kalusu. Na vytvorenie kalusu sa používajú rôzne explantáty, z ktorých sa potom vytvárajú výhonky. Na získanie morfogénneho kalusu z viacročných rastlín je potrebné vziať vrcholy výhonkov alebo časti meristematických tkanív, ktoré sú z nich izolované. Takýto systém sa neodporúča na mikropropagáciu rastlín in vitro z dôvodu genetickej nestability. Nepriama morfogenéza je dôležitá pre štúdium somaklonálnej variability a získanie somaklonálnych variantov.

Vo Veľkej Británii sa na oddelení fyziológie experimentálnej stanice Maidstone študovala regenerácia rastlín zo stonkového a listového kalusu v podpníku čerešne Colt. Iniciácia kalusu sa uskutočnila na médiu Mourasige-Skoog obsahujúcom 2,0 až 10,0 mg/l NAA. Výsledný kalus sa preniesol do regeneračného média obsahujúceho BAP v koncentrácii 0,5 mg/l. V tomto čerešňovom podpníku bolo možné realizovať regeneráciu výhonkov z kalusov.

V Centrálnom genetickom laboratóriu pomenovanom po I. V. Michurinovi bola v kultúre pasivovaných kalusových tkanív získaných z jednoročných výhonkov čerešní zaznamenaná tvorba koreňov. Pri prenose do média s regulátormi rastu sa pozoroval výskyt meristematických útvarov.

Somatická embryogenéza

Ďalšou metódou mikroklonálnej reprodukcie rastlín in vitro je somatická embryogenéza, proces tvorby zárodočných štruktúr zo somatických (nepohlavných) buniek. Somatické embryo je nezávislá bipolárna štruktúra, fyzicky nepripojená k tkanivu, z ktorej sa vytvorí štruktúra, v ktorej sa súčasne vyvíjajú vrcholy stonky a koreňov.

K tvorbe somatických embryí v kultúre buniek, tkanív a orgánov môže dochádzať priamo alebo nepriamo. Priama somatická embryogenéza - tvorba vegetatívneho embrya z jednej alebo viacerých buniek tkaniva explantátu bez štádia tvorby intermediárneho kalusu. Nepriama embryogenéza pozostáva z niekoľkých fáz: umiestnenie explantátu do kultúry, následná stimulácia rastu kalusu a tvorby preembryí z buniek kalusu, prenos kalusu do živného média bez rastových faktorov za účelom vytvorenia bipolárnych embryí z preembryí.

V práci bola skúmaná možnosť regenerácie rastlín z kalusov získaných z koreňov čerešňových podpníkov. Kalus bol získaný buď z odrezaných koreňov alebo z celých rastlín pestovaných v sterilných podmienkach mikroklonovaním čerešňových výhonkov. V podpníku čerešne Colt kalus získaný z koreňov neporušených rastlín vytvoril výhonky a štruktúry podobné embryoidom. Čerešňové kalusy sa kultivovali na médiu Murashige-Skoog doplnenom o BAP, HA a NAA. Frekvencia tvorby výhonkov bola vyššia ako u paralelne analyzovaných jabloní. Regeneračné rastliny sa rozmnožili cez tkanivovú kultúru a presadili sa do pôdy. Sadenice regenerovaných rastlín získané z kalusov čerešňových podpníkov sa fenotypom nelíšili od pôvodných podpníkov.

Indukcia somatickej embryogenézy u odrôd čerešní (Prunus cerasus L.) bola pozorovaná pri kultivácii explantátov na médiu Murashige-Skoog doplnenom rôznymi kombináciami auxínov a cytokinínov. K somatickej embryogenéze dochádzalo hlavne vtedy, keď sa použila kombinácia 2,4-D a kinetínu. Indukcia somatickej embryogenézy bola tiež zaznamenaná, keď sa do indukčného média pridalo 0,1 mg/l IBA. Použitie NAA alebo 6-BAP znížilo indukciu somatickej embryogenézy a zvýšilo frekvenciu nepriamej regenerácie u odrôd čerešní (Prunus cerasus L.).

Doteraz sa za najspoľahlivejší spôsob získania geneticky identických potomkov považuje mikropropagácia ovocných kôstkovín s axilárnymi púčikmi v porovnaní so somatickou embryogenézou, rozmnožovanie s adventívnymi púčikmi a nepriama morfogenéza.

1. Polevoy V. V., Chirkova T. V., Lutova L. A. et al. Workshop o raste a odolnosti rastlín: Návod. SPb., 2001. S. 208.

2. Sorokina I. K., Starichkova N. I., Reshetnikova T. B., Grin N. A. Fundamentals of plant biotechnology. Kultúra rastlinných buniek a tkanív: učebnica. 2002, s. 45.

3. Chernets A. M., Abramenko N. M., Stakanova R. V. Vývoj metódy na dlhodobé skladovanie in vitro bezvírusových klonov ovocných stromov a jahôd // Abstrakty medzinárodnej konferencie: Biológia kultivovaných buniek a biotechnológie. Novosibirsk, 1988.

4. Romanova N. P., Ulyanova E. K. O skladovaní jahodových mericlonov in vitro // Vedecký a technický bulletin Výskumného ústavu rastlinného priemyslu N. I. Vavilova. L., 1990. Vydanie. 204. S. 75-79.

5. Orlova S. Yu Biologické vlastnosti a šľachtiteľská hodnota odrôd čerešní v podmienkach severozápadného Ruska: Abstrakt práce. dis. ... cukrík. biol. vedy. SPb., 2002. S. 20.

6. Niino Takao, Tashiro Kazuo, Suzuki Mitsuteru, Ohuchi Susumu, Magoshi Jun, Akihama Tomoya. Kryoprezervácia in vitro pestovaných výhonkov čerešní a čerešní jednostupňovou vitrifikáciou // Scientia Horticulturae. 1997 Vol. 70. S. 155-163.

7. Vysotsky V. A. Kultúra izolovaných tkanív a orgánov ovocných rastlín: liečenie a mikroklonálna reprodukcia // Poľnohospodárska biológia: Mesačný vedecký a teoretický časopis. M., 1983. č. 7. S. 42-47.

8. V. V. Faustov, E. V. Oleshko, I. V. Zharkova, Z. M. Asadulaev a Kh.

B., Ismail H. Cherry micropropagation // Proceedings of TSKhA. M., 1988. Číslo 5. S. 131-148.

9. Rastlinná biotechnológia: bunková kultúra // Per. z angličtiny. V. I. Negruk / Ed. R. G. Butenko. M., 1989. S. 233.

10. Demenko V. I., Trushechkin V. G. Reprodukcia čerešní metódou in vitro // Agricultural biology: Mesačný vedecký a teoretický časopis. M., 1983. č. 7.

11. V. I. Kašin, A. A. Borisová, Yu, N. Prichodko, O. Yu. M., 2001. S. 97.

12. Shipunova A. A. Klonálna mikropropagácia ovocných rastlín: Abstrakt práce. dis. ... cukrík. poľnohospodárske vedy. M., 2003. S. 24.

13. Trushechkin V. G., Vysotsky V. A., Oleshko E. V. Mikropropagácia odrôd a podpníkov plodín kôstkového ovocia: Pokyny. M., 1983. S. 16.

14. Dráha W. D. Regenerácia rastlín hrušiek z meristemtipov výhonkov, Plant Sci. písmená. 1979 zv. 16. Číslo 2/3. R. 337-342.

15. FossardR. A., Bourne R. A. Zníženie nákladov na tkanivové kultúry na komerčné rozmnožovanie // Tkanivová kultúra na záhradnícke účely. Acta Hort. 1977 Vol. 78. R. 37-44.

17. Oleshko E. V. Zvláštnosti klonálnej mikropropagácie podpníkov a kultivarov čerešní: Abstrakt práce. dis. ... cukrík. biol. vedy. M., 1985. S. 15.

18. Khaak E. R., Nuust Yu. O. Klonálna mikropropagácia plodín kôstkového ovocia // Záhradníctvo a vinohradníctvo. M., 1989. č. 1. S. 27-29.

19. Dudchenko O.P. Regenerácia v kultúre izolovaných meristémov slivky // Abstrakty z medzinárodnej konferencie „Biológia kultivovaných buniek a biotechnológia 2“. Novosibirsk, 1988. S. 358.

20. Kornatsky S. A., Vysotsky V. A., Trushechkin V. G. Problémy klonálnej mikropropagácie plodín kôstkového ovocia // Úspechy v pestovaní ovocia v mimočernozemskej zóne RSFSR: So. vedecký Tvorba. M., 1991. S. 104-116.

21. Indukcia morfogenézy a selekcie tkaniva ovocných a bobuľových plodín: Pokyny / Ed. V. E. Perfilieva. 1996, s.

22. Svitailo A. M., Bondarenko P. E., Shevchuk N. S. Klonálna mikropropagácia podpníkov a odrôd ovocných plodín // Abstrakty medzinárodnej konferencie „Biológia kultivovaných buniek a biotechnológia 2“. Novosibirsk, 1988. S. 346.

23. Trushechkin V. G., Vysockij V. A., Kornatsky S. A. Klonálna mikropropagácia plodín kôstkového ovocia v systéme produkcie zdravého sadivového materiálu // Abstrakty medzinárodnej konferencie: Biológia kultivovaných buniek a biotechnológia 2. Novosibirsk. 1988. S. 319-320.

24. Hammatt N., Grant N. J. Mikropropagácia zrelej britskej divokej čerešne // Rastlinná bunková, tkanivová a orgánová kultúra. 1997 Vol. 47. S. 103-110.

25. Dzhigadlo M. I. Využitie biotechnologických a biofyzikálnych metód pri šľachtení a šľachtení kultivarov ovocných a bobuľových plodín: Abstrakt práce. dis. ... cukrík. poľnohospodárske vedy. Mičurinsk, 2003, s. 25.

26. Ruzic D., Saric M., Cerovic R., Culafic I. Vzťah medzi koncentráciou makroprvkov, ich príjmom a množením čerešňového podpníka Gisela 5 in vitro // Plant Cell Tissue Organ Cult. 2000 Vol. 63. S. 9-14.

27. Kornatsky S. A. Zvláštnosti klonálnej mikropropagácie slivky v systéme vylepšeného sadbového materiálu: Abstrakt práce. dis. ... cukrík. poľnohospodárske vedy. M., 1991. S. 24.

28. Dzhigadlo M. I., Dzhigadlo E. N. Reprodukcia čerešní metódou vrcholových meristémov // Zdokonaľovanie sortimentu a progresívne metódy pestovania plodín ovocia a bobúľ: Zbierka. Tula, 1988, s. 65-68.

29. Vysotsky V. A., Oleshko E. V. Zlepšenie živného média pre klonálnu mikropropagáciu čerešní // Poľnohospodárska technológia a odrodová štúdia ovocných plodín: So. vedecký Tvorba. M., 1985. S. 72-76.

30. Chernets A. M. Vplyv minerálnej výživy na intenzitu premnoženia odrôd čerešní in vitro // Abstrakty medzinárodnej konferencie "Biológia kultivovaných buniek a biotechnológie 2". Novosibirsk, 1988. S. 343.

31. Nedelcheva S., Ganeva D. Reprodukcia in vitro na troch vegetatívnych substrátoch z rodu Prunus // Rasten. vedy. 1985. V. 22. Číslo 8. S. 98-104.

32. Boleriola-Lucas C., Millins M. G. Mikropropagácia dvoch francúzskych kultivarov sliviek (Prunus domesticaL.) // Agronomie. 1984 Vol. 4. č. 5. R. 473-477.

33. Vysotsky V. A., Oleshko E. V. Použitie mikroštepenia pri klonálnej mikropropagácii plodín kôstkového ovocia // Poľnohospodárska biológia. M., 1988. č. 4. S. 75-77.

34. Plaksina T.V. Využitie biotechnológie pri šľachtení čerešní na Altaji // Zborník z vedeckej a praktickej konferencie k 70. výročiu NIISS im. M. A. Li-savenko: Problémy trvalo udržateľného rozvoja záhradníctva na Sibíri. Barnaul, 2003, s. 108-110.

35. Vysockij V. A. Vplyv niektorých rastových regulátorov na izolované meristematické vrcholy čiernych ríbezlí // Plodovodstvo i pestovanie bobúľ mimočernozemnej zóny: Zbierka. M. 1979. Ročník IX. s. 101-107.

36. LutovaL. A. Biotechnológia vyšších rastlín: Učebnica. SPb., 2003. S. 227.

37. Vysotsky V. A. O genetickej stabilite počas klonálnej mikropropagácie ovocných a bobuľových plodín // Poľnohospodárska biológia. 1995. č. 5. S. 57-63.

38. De Klerk G.-J. Arnholdt-Schmitt B., Lieberei R. Regenerácia koreňov, výhonkov a embryí: fyziologické, biochemické a molekulárne aspekty // Biology Plantarum. Vol. 39. č. 1. 1997. R. 53-66.

39. Tang H., Ren Z., Reustle G., Krczal G. Obnova rastlín z listov kultivarov sladkých a višní // Scientia Horticulturae. 2002 Vol. 93. S. 235-244.

40. Bhagwat B., David Lane W. In vitro regenerácia výhonkov z listov čerešne (Prunus avium) "Lapins" a "Sweetheart // Plant Cell, Tissue and Organ Culture. Holandsko. 2004. Vol. 78. S. 173 -181.

41. Gentile A., Monticelli S., Damiano C. Náhodná regenerácia výhonkov v broskyni, Plant Cell Reports. 2002 Vol. 20. S. 1011-1016.

42. Takashina T., Nakano H., Kato R. Efektívna kultúra regenerácie rastlín z listových explantátov in vitro pestovaných čerešní // Acta Horticulturae: XXVI. Medzinárodný záhradnícky kongres: Genetika a šľachtenie stromových plodov a orechov. R. 622.

43. Burgos L., Alburquerque N. Inhibítory etylénu a nízke koncentrácie kanamycínu zlepšujú náhodnú regeneráciu z marhuľových listov // Plant Cell Reports. 2003 Vol. 21. S. 1167-1174.

44. Hammatt N., Grant N. J. Regenerácia výhonkov z listov Prunus serotina Ehrh. (čierna čerešňa) a P. avium L. (divá čerešňa) // Plant Cell Reports. 1998 Vol. 17. S. 526-530.

45. Grant Neil J., Hammatt Neil. Náhodný vývoj výhonkov z listov divokej čerešne (Prunus avium L.) // New Forests. Holandsko. 2000 Vol. 20. str. 287-295.

46. ​​​​James D. E., Possey A. J., Mahotro S. B. Organogenesis in kalus odvodený z kmeňových a listových tkanív jabloní a čerešní podpníkov, Plant Cell Tissue Organ Cult. 1984 Vol. 3. č. 4.

47. Tyulenev V. M., Naftaliev N. M., Osipova L. V., Rastorguev S. L. Klonálna mikropropagácia cenných genotypov ovocných plodín // Abstrakty medzinárodnej konferencie "Biológia kultivovaných buniek a biotechnológia 2". Novosibirsk, 1988, s. 320.

48. Jones OP, Jacqueline A. Gayner a Watkins R. Regenerácia rastlín z kalusových tkanivových kultúr čerešňových koreňov Colt (Prunus avium x P. pseudocerasus) a jabloní M. 25 (Malus pumila) // The Journal of Záhradnícka veda. Anglicko. 1984 Vol. 59. Číslo 4. S. 463-467.

49. Tang Haoru, Ren Zhenglong, Krczal Gabi. Somatická embryogenéza a organogenéza z nezrelých zárodočných kotyledónov troch kultivarov višní (Prunus cerasus L.) // Scientia Horticulturae. 2000 Vol. 83. S. 109-126.

V. Rogovaia, M. Gvozdev

IN VITRO KLONÁLNA MIKROPROPAGÁCIA KAMEŇOVO-OVOCNÝCH KULTÚR

Prehľad je zameraný na základné štádiá a metódy in vitro klonálnej mikropropagácie kultúr kôstkového ovocia. Osobitný dôraz sa kladie na pomocnú techniku ​​rozmnožovania púčikov a metódu náhodnej obnovy výhonkov z listových explantátov višne, čerešne, broskyne a marhule. Preskúmali sa niektoré aspekty testovania rastlinného materiálu na vírusové infekcie, ako aj určité problémy zachovania genetickej stability v závislosti od modelu šírenia.

Bunky starnú nielen in vivo, ale aj in vitro. Navyše v podmienkach in vitro sa obzvlášť zreteľne prejavuje úloha hyperoxie, prirodzeného a zrejme jediného faktora ich starnutia za týchto podmienok.
1.8.1. Ako viete, kultivácia buniek mimo tela sa vykonáva v špeciálnych nádobách (bankách) s atmosferický tlak a následne pri pO2 výrazne prevyšujúcom hodnoty, ktoré sú normálne stanovené v tele. Zvyčajne je v inkubačnej kvapaline pO2 blízko pO2 vzduchu. Molekuly O2 voľne difundujú k bunkám cez tenkú vrstvu živného média v banke a v nich sa vytvorí vysoké pO2, čo je in vivo nemožné alebo v každom prípade prekračuje prípustné hodnoty.
Z hľadiska kyslíkovo-peroxidového konceptu starnutia sa podmienky in vitro javia ako viac než vhodné na štúdium procesu starnutia buniek, keďže za týchto podmienok prebieha intenzívnejšie, zrýchleným tempom a čo je veľmi dôležité , v „čistej“ forme, tzn pri úplná absencia akýkoľvek vplyv telesných systémov, ku ktorému dochádza počas starnutia in vivo. Táto okolnosť okamžite zaraďuje mnohé teórie starnutia do kategórie sekundárnych alebo čisto špekulatívnych, pretože k zmenám súvisiacim s vekom dochádza alebo môže dôjsť aj bez implementácie v nich predpokladaných ustanovení. To, že fenoménu starnutia buniek in vitro prikladáme taký význam, je spôsobené tým, že práve za týchto „jednoduchých“ podmienok bude možné rýchlo a s menšími problémami pochopiť fyzikálno-chemické základy starnutia a podstatu starnutia. biológia tohto procesu vo všeobecnosti.
V súčasnosti však neexistuje konsenzus o zhode príčin a mechanizmov starnutia bunkových kultúr a starnutia buniek v mnohobunkovom organizme, o čom svedčia opačné názory v literatúre (Kapitanov, 1986). Napríklad Kanungo (Kanungo, 1982), hoci sa domnieva, že príčinou starnutia organizmu je starnutie jeho buniek, zároveň sa domnieva: „podmienky in vitro nezodpovedajú fyziologickým a vlastnosti buniek sa môže zmeniť. Ak štúdie in vitro poskytnú nejaké užitočná informácia o bunke samotnej, majú obmedzenú hodnotu, pokiaľ ide o starnutie organizmu ako celku.“ S vyššie uvedeným tvrdením možno súhlasiť len čiastočne. Starnutie buniek in vitro totiž nemôže odrážať celé komplexné spektrum zmien súvisiacich s vekom, ktoré sa vyskytujú v celom organizme na všetkých úrovniach a navyše do značnej miery determinované systémom rôznych súvislostí v ňom, vrátane reverzných. Čo sa týka podmienok in vitro, množstvo princípov starnutia, ktoré sa prejavujú na úrovni organizmu, strácajú svoj význam (pozri časť 1.1.2), ale niektoré z nich naďalej fungujú v bunkových kultúrach. Takými sú najmä multifokálny charakter procesu starnutia, t.j. vývoj poškodenia v rôzne časti bunkami alebo v ich rôznych molekulárnych cykloch a heterochróniou starnutia medzi bunkami rovnakého kultivovaného typu. Okrem toho by sa za týchto podmienok mali zrejme jasnejšie prejaviť princípy nezvratnosti, nekontrolovateľnosti a kontinuity starnutia buniek.
Uvedené nedostatky v skúmaní starnutia buniek mimo tela sa nezdajú byť zásadné, ak si uvedomíme, že jednou z hlavných úloh gerontológie je stanoviť hlavný primárny faktor prostredia, ktorý podmieňuje starnutie všetkých živých organizmov. Takýmto faktorom, ako veríme, je hyperoxia zemská atmosféra Preto možno život buniek v podmienkach in vitro považovať za vhodný experimentálny model na štúdium účinku tohto konkrétneho fyzikálneho faktora na starnutie buniek. Zvyčajný 18-21% obsah O2 vo vzduchu, a teda vysoká nerovnováha Δ (PO - AO) a procesy peroxygenázy majú tlmivý účinok na subcelulárne elementy, na normálne fyziologické a metabolické procesy. Výsledkom je, že tieto postupne vyblednú a väčšina buniek odumiera v dôsledku oxidačnej cytolýzy alebo prostredníctvom mechanizmu apoptózy kyslík-peroxid (pozri časť 7.1).
Existuje viac než dosť faktov, ktoré poukazujú na vedúcu úlohu nadbytku pO2, ROS a LPO pri znižovaní prežitia buniek v podmienkach in vitro a ochranného účinku rôznych antioxidačných faktorov (Branton a kol., 1998; Drukarch a kol., 1998; Heppner a kol., 1998). Medzi posledné menované sa v poslednej dobe zaraďuje aj L-karnozín. Pridanie jeho fyziologických koncentrácií do štandardných médií zvyšuje životnosť ľudských fibroblastov in vitro a spomaľuje v nich procesy fyziologického starnutia. Bunky pasážované na bežnom médiu dlhú dobu po prenesení do média obsahujúceho karnozín vykazovali omladzujúci účinok. Optický izomér D-karnozínu nemal uvedené vlastnosti (Hallyday a McFarland, 2000) Zároveň pri dlhodobej kultivácii určité percento buniek nielenže nedegraduje, ale prispôsobí sa toxické oxidačné podmienky, „dosahuje“, že vnútrobunkový parameter Δ (PO - AO) nestúpne na vysoké hodnoty ΔA2 alebo ΔC, ale môže sa zastaviť na mierne nižšej hladine ΔK, ktorá je potrebná pre ich malígnu premenu. Prípady „spontánnej“ bunkovej malignity v kultúre a jej možný mechanizmus rozoberáme samostatne v kapitole 4.
1.8.2. Vyššie uvedené úvahy možno považovať za súčasť našich teoretických návrhov o príčinách a následkoch starnutia buniek in vitro. Na potvrdenie a rozvinutie týchto ustanovení je prirodzené vychádzať z niektorých už známych faktov, ktorých obsah a zmysel možno ľahko „vpísať“ do kyslíkovo-peroxidového konceptu starnutia buniek. Začnime tým, že vyššie popísané obvyklé podmienky pre kultiváciu buniek, ktoré sú pre ne toxické, je možné zmierniť umelým znížením koncentrácie O2 v plynnom prostredí. V tomto prípade by sa mal znížiť inhibičný účinok hyperoxie a rýchlosť starnutia buniek. Treba mať na pamäti aj to, že taká známa biologická konštanta, akou je Hayflickov limit, sa v skutočnosti ukázala ako premenlivá hodnota v závislosti od obsahu O2 v plynnom prostredí, pričom táto hranica klesá v podmienkach oxidačného stresu, resp. naopak, zvyšuje sa s poklesom pO2 (Chen et al., 1995).
Prítomnosť kultúry fibroblastov v atmosfére s nízkym obsahom O2 (10%) totiž predlžuje ich životnosť o 20-30%. To isté sa deje s ľudskými a myšími pľúcnymi bunkami (Packer a Walton, 1977). Obdobie proliferačnej životaschopnosti diploidných ľudských fibroblastov IMR90 s rôznymi počiatočnými úrovňami zdvojnásobenia populácie sa zvyšuje so znížením obsahu O2 v médiu na 1,6 alebo 12%. Toto obdobie pri 1 % O2 sa zvyšuje o 22 % a návrat kultúr z média s 1 % O2 do média s 20 % O2 rýchlo rozvíja ich starnutie. V kultúre diploidných fibroblastov od pacienta s Wernerovým syndrómom (skoré starnutie) sa trvanie replikačnej životaschopnosti tiež zvyšuje s poklesom pO2 (Saito et al., 1995). Spomalenie starnutia kultivovaných chondrocytov kuracích embryí sa ukázalo pri 8 % obsahu O2 v atmosfére v porovnaní s kontrolou (18 %) a experimentálne bunky si dlhšie zachovali znaky „mladosti“ a mali vyššiu mieru proliferácie (Nevo et al., 1988). Vplyvom rôznych antioxidantov sa tiež zvyšuje rýchlosť proliferácie bunkových kultúr a spomaľuje sa ich starnutie (Packer a Walton, 1977; Obukhova, 1986), čo potvrdzuje to, čo už bolo povedané vyššie: zjavne nadmerné pôsobenie oxidantov potláča bunky bujnenie a spôsobuje ich zrýchlené starnutie.
Pri pokusoch s bunkovými kultúrami je tiež pomerne jednoduché overiť pôsobenie O2-dependentného mechanizmu regulácie množstva respiračných enzýmov (Murphy et al., 1984; Suzuki et al., 1998) a mitochondrií (Ozernyuk, 1978 ). Podľa tohto mechanizmu by sa pri plynulom a pomalom zvyšovaní hladiny hyperoxie mal obsah takýchto enzýmov a počet mitochondrií postupne zvyšovať, pri hypoxii by naopak mali klesať. Keď sa kultivované fibroblasty pestujú na médiu s nízkym obsahom O2, koncentrácia cytochrómov sa výrazne zníži (Pius, 1970). Tu sa samozrejme podieľa na objektívnom procese adaptácie dýchacieho systému na vnútrobunkovú úroveň pO2. Pri tomto fenoméne je však nemenej dôležitá rýchlosť adaptácie, od ktorej bude závisieť aj intenzita starnutia kultivovaných buniek. Zdá sa zrejmé, že v procese biologickej evolúcie sa mnohobunkový organizmus prispôsoboval postupnému zvyšovaniu pO2 v zemskej atmosfére aj postupne. „Mitochondriálny“ adaptačný mechanizmus možno zároveň považovať za najúčinnejší vo vnútri buniek: počet enzýmov dýchacieho reťazca a samotných mitochondrií sa mení samoorganizujúci sa systém tak, že zabezpečuje integritu a relatívne normálne fungovanie buniek. so zmenami intracelulárneho pO2 v rámci určitých evolučne schválených limitov.
Úplne iná situácia nastáva, keď sa bunky rýchlo prenesú zo živého organizmu do podmienok in vitro. Ich náhly prechod do stavu hyperoxie sa rovná tomu, že im spôsobí výrazný kŕčovitý rušivý efekt, na ktorý vo všeobecnosti nie sú pripravené. Ako reaguje primárna bunková kultúra na takéto narušenie? Zdá sa, že počas určitého počiatočného obdobia je kultivačné médium pre bunky „stresové“ a stav buniek samotných počas tohto obdobia je šokový. Potom sa nejaký čas strávi prípravou a realizáciou adaptačných „opatrení“ antioxidačnej povahy, ktoré sú možné za týchto extrémnych podmienok. Pravdepodobne vďaka tomu možno najskôr nielen zabrániť oxidačnej degradácii, ale aj vytvoriť podmienky pre stimuláciu proliferačného procesu, čím sa zníži pôvodne vysoká, jednoznačne „cytotoxická“ vnútrobunková nerovnováha ΔC (PO – AO) na úroveň nevyhnutnú pre oxidačnú mitogenézu. Avšak ani táto etapa života primárnej kultúry nemôže byť obmedzená hyperoxickým prostredím, ktoré ju neustále utláča. V tejto situácii sa začína inaktivovať samotný adaptačný mechanizmus a v dôsledku toho sa znižuje budovanie antioxidačného systému a následne dochádza k jeho regresii. Pri vysokej hladine LPO dochádza v prvom rade k poškodeniu mitochondrií (pozri časť 1.3), ktorých počet by sa v prípade postupného zvyšovania pO2 v plynnom prostredí naďalej zvyšoval ako adaptačný akt.
Neschopnosť adaptačných mechanizmov bunky rýchlo a úplne neutralizovať náhlu hyperoxiu na jednej strane a vysoká zraniteľnosť mitochondriálnej väzby na peroxidačný stres na strane druhej podmieňujú nezvratný proces bunkovej degenerácie po vzniku tzv. „kritickú úroveň“ poškodenia v nich. Tu je dôležité ešte raz poznamenať: deštruktívne zmeny v mitochondriách ako hlavných konzumentoch O2 a v tomto zmysle aj ako hlavný krok antikyslíkovej ochrany v antioxidačnom systéme bunky nezanechávajú nádej na prežitie pre väčšinu buniek pod drsné podmienky in vitro, pretože v tomto prípade je adaptácia narušená - mechanizmus znižovania intracelulárnych hladín pO2 a LPO. Tieto úvahy sú plne v súlade s primárnou úlohou mitochondriálnych zmien pri iniciácii mechanizmu starnutia, čo sa však predpokladá vo vzťahu k fibroblastom kultivovaným in vitro (Kanungo, 1980).
Peroxidačný stres a toxický účinok v podmienkach in vitro možno ďalej zvýšiť, ak sa do kultivačného média zavedú katalyzátory LPO, ako sú ióny Fe2+ alebo Cu2+. Pridanie síranu meďnatého v koncentrácii 60 mg/l do kultivačného média totiž viedlo k výraznému zníženiu priemernej dĺžky života vírnikov o 9 %, ako aj k výrazne citeľnejšiemu zvýšeniu množstva MDA ako v r. kontrola. Autori tohto experimentu (Enesco et al., 1989) sa logicky domnievajú, že k zníženiu strednej dĺžky života dochádza v dôsledku zrýchlenia procesov tvorby voľných radikálov iónmi medi. Uvedená koncentrácia síranu meďnatého sa ukázala ako optimálna, keďže vyššie koncentrácie (90 a 180 mg/l) boli pre vírniky príliš toxické a nižšie (30 mg/l) boli neúčinné.
Ireverzibilné zrýchlené starnutie a oxidačná degradácia buniek počas prudkej zmeny biotopu z in vivo na in vitro sú teda výsledkom ich nedostatočnej pripravenosti akceptovať také prudké zvýšenie expozície kyslíkom bez vážnych negatívnych následkov. Ak je takýto prudký prechod na nové podmienky nahradený „mäkkým“, napríklad viacstupňovým a predĺženým v čase, potom možno očakávať, že schopnosť buniek prispôsobovať sa postupne sa zvyšujúcej hyperoxii sa v tomto prípade plne realizuje. Navyše, v zásade je týmto spôsobom možné dosiahnuť adaptáciu buniek nielen na zvyčajnú úroveň 18-21% O2 v atmosfére, ale aj na umelo vytvorené hyperoxické prostredia, ktoré sú od nej podstatne vyššie. Na podporu toho, čo bolo povedané, odkazujeme na veľmi presvedčivé fakty, ktoré získali Welk et al. (Valk a kol., 1985). V dôsledku postupnej adaptácie na zvyšujúcu sa koncentráciu O2 získali bunkovú líniu vaječníkov čínskeho škrečka, ktorá je odolná voči vysokému obsahu O2 a schopná proliferácie aj pri 99 % O2 v atmosfére. Takejto výraznej hyperoxii a procesom na nej závislým sa ukázali byť prispôsobené všetky stupne ochrany – antikyslíková, antiradikálová a antiperoxidová (podrobnejšie o týchto výsledkoch pozri kapitolu 4).
1.8.3. Vyššie uvedené úvahy o znakoch zmien v prooxidačno-antioxidačnej nerovnováhe v kultivovaných bunkách ako hlavnom aktívnom faktore ich starnutia a transformácie možno podmienečne znázorniť graficky (pozri obr. 11). Krivka 1, ktorá odráža tieto zmeny počas rýchleho pohybu buniek do média in vitro, ukazuje tri postupné štádiá v čase, ktoré sa zdajú zodpovedať adaptačnej (latentnej) fáze, logaritmickej fáze rastu a stacionárnej fáze známej v literatúre. V tomto prípade je starnutie bunkových kultúr zvyčajne spojené s procesmi v stacionárnej fáze, kde postupom času prechádzajú rôznymi zmenami podobnými tým, ktoré sú pozorované v bunkách starnúceho organizmu (Kapitanov, 1986; Khokhlov, 1988). Najmä enzýmy sa počas starnutia buniek in vitro menia a dochádza k ich aneu- a polyploidizácii (Remacle, 1989). Podobne ako bunky in vivo, aj kultivované bunky starnutím akumulujú granule lipofuscínu (Obukhova a Emanuel, 1984), čo naznačuje zjavný výskyt peroxidových procesov a oxidačných porúch v štruktúre lipidov a proteínov. Tieto a množstvo ďalších faktov, tak či onak, môže byť v súlade s hypotézou mechanizmu starnutia kyslík-peroxid (voľné radikály). Tento mechanizmus podporujú predovšetkým údaje, že pri zvyšovaní koncentrácie antioxidantov je životnosť buniek in vitro dlhšia a pri poklese kratšia ako pri kontrole. Takéto výsledky sa získali napríklad zmenou obsahu GSH v ľudských fibroblastoch (Shuji a Matsuo, 1988), katalázou a SOD v kultivovaných neurónoch (Drukarch et al., 1998).
Pokiaľ ide o ploché a relatívne hladko rastúce krivky 2 na obr. 11 sa tento ich charakter vysvetľuje tým, že každý malý umelo vytvorený prírastok prooxidačnej zložky nerovnováhy Δ (PO - AO) v bunke je nasledovaný s určitým oneskorením zodpovedajúcim adaptívnym prírastkom antioxidačnej zložky v nej. Opakované opakovanie tohto pôsobenia zabezpečuje adaptáciu a prežitie buniek s postupným, stupňovitým zvyšovaním úrovne hyperoxie.
V oboch týchto prípadoch si dajme pozor na možnosti vedúce k takzvanej „samovoľnej“ malignancii buniek (pozri kapitolu 4). Tento jav je z nášho pohľadu možné realizovať iba v tých bunkách, kde nerovnováha dosahuje hodnoty ΔK, ktoré konzistentne spĺňajú nerovnosť (pozri článok 1.1.2)
ΔP (PO - AO), alebo skôr, berúc do úvahy „apoptotické“ nerovnováhy, k pomeru (pozri odsek 7.1.1)
ΔA1 (PO - AO) Pomocou takýchto postupov sa v konečnom dôsledku vytvoria transplantovateľné línie transformovaných a nádorových buniek, schopné dlhodobej existencie mimo tela. V kontexte problémov, ktoré zvažujeme, je dôležitejšie určiť prístup k štúdiu vzťahu medzi starnutím a karcinogenézou. Jeden z nich, a to štúdium samotného procesu objavenia sa nádorových buniek počas starnutia normálnych bunkových kultúr (Witten, 1986), sa javí ako najprirodzenejší, a preto preferovaný.

prístup. Keď sa vytvorí nerovnováha Δ (PO - AO) v intervale medzi AK a AC, bunky môžu podstúpiť apoptózu typu A2 (pozri časť 7.1.1).
Podľa telomerickej teórie je replikatívne starnutie buniek, vrátane podmienok in vitro, spojené so skrátením telomér po každej mitóze až na určitú minimálnu dĺžku, čo vedie k strate schopnosti takýchto buniek deliť sa (pozri časti 1.4.3 a 1.4). .4). Analýza známej literatúry o tejto problematike ukazuje, že tento postulát sa v niektorých prípadoch nepotvrdzuje. Príkladom toho je štúdia Karmana a kol. (Carman et al., 1998) uskutočnené na diploidných embryonálnych bunkách škrečka sýrskeho (SHE). Tieto bunky prestali proliferovať po 20-30 cykloch zdvojenia a po stimulácii sérom stratili schopnosť vstúpiť do S-fázy. Bunky SHE zároveň exprimovali telomerázu počas celého replikačného životného cyklu a priemerná veľkosť telomér sa nezmenšila. Ukazuje sa, že bunky in vitro môžu niekedy starnúť mechanizmami, ktoré nie sú spojené so stratou telomér.
Zdá sa nám, že v tomto prípade podmienky hyperoxie v kultivačnom médiu robia svoje vlastné úpravy. Ak v stave mierne zvýšenej hladiny ROS a peroxidácia často vykonávajú pozitívne funkcie, aktiváciu jednotlivých štádií prechodu mitogénneho signálu, replikácie, transkripcie a iných procesov (o tom sme hovorili v niekoľkých predchádzajúcich odsekoch a je spomenuté v niektoré následné), potom v prípade intenzívneho oxidačného stresu nevyhnutné a negatívne dôsledky. Napríklad môžu byť modifikované niektoré makromolekuly, vrátane tých, ktoré sa podieľajú na mitogenéze, ktoré by bez ohľadu na telomerázovú aktivitu a dĺžku telomér mali inhibovať proliferáciu a/alebo indukovať niektoré ďalšie poruchy, vrátane bunkovej smrti.
Nech je to akokoľvek, najpravdepodobnejšie zostávajú dve príčiny starnutia buniek in vitro – hromadenie chýb v podmienkach ich udržiavania v kultúre a skracovanie telomér. Predpokladá sa, že v oboch prípadoch sú aktivované proteínové systémy p53 a Rb a keď je ich funkcia narušená, dochádza k bunkovej transformácii (Sherr a DePinho, 2000). Všeobecnejšie vidíme nasledovné: v toxických hyperoxických podmienkach kultivácie normálne bunky, starnutie, s najväčšou pravdepodobnosťou podliehajú A1 apoptóze a nádorové bunky A2 apoptóze. V prípade porúch v mechanizme apoptózy prvé z nich podliehajú neoplastickej transformácii, zatiaľ čo druhé podliehajú oxidatívnej cytolýze (pozri časť 7.1.1).
Za ďalší dôvod, ktorý prispieva k zintenzívneniu procesov oxidačnej degradácie v bunkách in vitro, možno považovať teplo, ako neustále pôsobiaci faktor. životné prostredie. Použitím vysoko citlivej metódy (opísanej Bruskovom a kol., 2001) sa skutočne ukázalo, že ROS vznikajú vo vodných roztokoch pôsobením tepla. V dôsledku tepelnej aktivácie atmosférického O2 rozpusteného vo vode dochádza k sledu reakcií
O2 → 102 → O → HO2˙ → H2O2 → OH˙.
Vzniknuté ROS zjavne prispievajú k tepelnému poškodeniu DNA a iných biologických molekúl ich „autooxidáciou“.
Na záver uvádzame ďalší spôsob zintenzívnenia procesu starnutia buniek v podmienkach in vitro pomocou anoxia-reoxygenačného postupu, ktorého výsledky podľa nášho názoru najjasnejšie odrážajú podstatu kyslíkovo-peroxidového modelu starnutia. Mechanizmus starnutia je v tomto prípade založený na dvoch základných efektoch: adaptívna redukcia (oslabenie) mitochondriálnej bázy počas anoxie alebo hypoxie (pozri vyššie); výrazné zvýšenie peroxidácie lipidov a iných procesov oxidačnej deštrukcie pri následnej reoxygenácii v dôsledku prudkého zvýšenia pO2 (vzhľadom na stav anoxie) a nemožnosti rýchleho využitia prebytku O2 „anoxickými“ mitochondriami. Stupeň peroxidačného stresu a následne aj rýchlosť starnutia buniek bude závisieť od dĺžky ich pobytu v stave anoxie: čím je toto obdobie dlhšie, tým lepšie sa mitochondriálna báza bude schopná adaptovať na nízku hladinu pO2 a tým výraznejšie bude poškodenie buniek po odstránení ischémie.
Nasledujúca skutočnosť môže slúžiť ako príklad realizácie starnutia buniek podľa naznačeného „scenára“. Hepatocyty izolované z potkanov rôzneho veku, boli podrobené 2-hodinovej anoxii a 1-hodinovej reoxygenácii. Zistilo sa, že v reoxygenačnej fáze hepatocyty produkujú veľké množstvo kyslíkových radikálov zodpovedných za poškodenie ich membrán a iné štrukturálne a funkčné zmeny spojené so starnutím a staré bunky boli citlivejšie na reperfúzne poškodenie (Gasbarrini et al., 1998 ). Podobné fakty uvažujeme aj my v kapitole 4 v súvislosti s diskusiou o mechanizme starnutia a „spontánnej“ malignity buniek v kultúre.

Na in vitro experimenty sa použila plná krv 11 klinicky zdravých ľudských dobrovoľníkov a 36 pacientov s tepelným poškodením.

2.3. Výskumné metódy

2.3.1. Imunologické metódy výskumu

2.3.1.1. Hodnotenie spontánnej a indukovanej sekrečnej aktivity mononukleárnych buniek periférnej krvi in ​​vitro

Predmetom štúdie bola venózna krv odobratá zdravým dobrovoľníkom a pacientom s tepelným poranením ráno nalačno. Krv sa stabilizovala heparínom v množstve 10 IU/ml. Frakcia mononukleárnych buniek bola izolovaná podľa metódy na hustotnom gradiente 1,077 g/ml centrifugáciou (400 g počas 45 minút) s použitím ficoll a verografinu. Na vytvorenie média s hustotou 1,077 g/cm3 sa použil 9 % (w/v) roztok ficoll-400 (Diam, Moskva) a 60 % oficiálny urografin (Schering, Nemecko). Opaleskujúci kruh mononukleárnych buniek sa odobral z medzifázy Pasteurovou pipetou a trikrát sa premyl centrifugáciou s médiom 199 pri 689 g počas 5-7 minút. Premyté a resuspendované bunky boli upravené na koncentráciu 1 x 107 buniek/ml. Ich životaschopnosť bola hodnotená zafarbením 0,2 % roztokom trypánovej modrej, životaschopnosť bola aspoň 98 %.

Kultivácia buniek sa uskutočňovala pri 5 % oxide uhličitom vo vzduchu pri teplote 37 °C počas 1 hodiny. Za sterilných podmienok sa obsah buniek odsal a následne sa dvakrát premyli z neadherentných buniek Hankovým roztokom. Potom sa do každej jamky pridalo 250 μl 10 % fetálneho teľacieho séra a 80 μg/ml gentamicínu. Ďalej boli bunky kultivované 72 hodín, v termostate pri 5 % oxidu uhličitého vo vzduchu, pri teplote 37 0 C, v supernatante bola stanovená koncentrácia cytokínov.

2.3.1.2. Výskum vrodenej imunity

Stanovenie počtu leukocytov a leukocytového vzorca. Počet leukocytov v periférnej krvi bol stanovený konvenčnou melanžovou metódou v Goryaevovej komore. Vzorec leukocytov sa vypočítal v krvných náteroch fixovaných metylalkoholom a zafarbených azúrovým II-eozínom podľa Romanovského-Giemsa. Spočítalo sa 200 leukocytov s diferenciáciou eozinofilov, bazofilov, metamyelocytov, bodných a segmentovaných neutrofilov, lymfocytov, monocytov. Ich počet bol vyjadrený v relatívnych (%) a absolútnych ( 10 9 /L) hodnotách.

Funkčná aktivita fagocytov bola študovaná v zmysle NBT-testu a fagocytózy.

Štúdium absorpčnej kapacity fagocytov periférnej krvi sa uskutočnilo na modeli absorpcie latexových častíc. Na posúdenie fagocytózy sa 200 μl krvi zmiešalo s 20 μl suspenzie častíc monodisperzného (priemer 1,7 μm) polystyrénového latexu. Po 60 minútach inkubácie pri teplote 37 0 C boli zo suspenzie pripravené prípravky, ktoré boli vysušené, fixované metanolom a farbené azúrom II - eozínom podľa Romanovského-Giemsa. Ponorná mikroskopia bola použitá na zohľadnenie aktivity fagocytózy - % buniek, ktoré zachytili aspoň jednu latexovú časticu, intenzitu fagocytózy - počet absorbovaných latexových mikroguľôčok v 100 spočítaných bunkách a fagocytárne číslo - počet absorbovaného latexu. mikrosféry na fagocyt.

NST-test sa uskutočnilo s prihliadnutím na intenzitu redukcie nitromodrej tetrazólia (NBT) fagocytmi na jeho nerozpustnú formu - diformazan podľa metódy A.N. Mayansky a M.E. Viksman (1979). Uskutočnil sa spontánny a indukovaný test NBT.

Do skúmaviek s 0,2 ml krvi sa pridalo 0,1 ml 0,2 % roztoku štandardne zriedeného nitrotetrazolia v 0,1 M fosfátovom pufri (pH 7,4). Na vyhodnotenie indukovaného testu HBT sa do každej jamky pridalo 20 μl suspenzie častíc monodisperzných (priemer 1,7 μm) polystyrénových latexových častíc (indukovaná séria) alebo 20 μl 0,9 % NaCl (spontánne série). Po 30 minútach inkubácie pri teplote 37 °C sa k reakčnej zmesi pridali 3 ml 0,1 % kyseliny chlorovodíkovej na zastavenie reakcie. Skúmavky sa centrifugovali pri 1000 ot./min. počas 5 minút. Supernatant sa odstránil, zo sedimentu sa pripravili nátery. Po vysušení boli prípravky fixované metanolom a farbené 5 minút 0,1 % vodným roztokom safranínu. Pomocou mikroskopie pri zväčšení 90x10x1,5 sme určili percento buniek, ktoré obnovujú NBT a intenzitu reakcie podľa aktivity redukcie NBT, pre ktorú boli bunky pozitívne na NBT rozdelené do 3 skupín:

1 - bunky s granulami diformazanu v cytoplazme s celkovou plochou menšou ako 1/3 plochy jadra;

2 - bunky s granulami diformazanu v cytoplazme nad 1/3 plochy jadra;

3 - bunky s granulami diformazanu presahujúcimi veľkosť jadra.

Na získanie koeficientu intenzity reakcie sa počet buniek v prvej skupine, vyjadrený v percentách, vynásobil 1, druhá skupina - 2, tretia - 3, výsledky boli sčítané a delené 100.