Rýchla metóda extrakcie DNA na mikrokolóne je určená na izoláciu celkovej DNA z krvi, plazmy, slín, moču, bunkových kultúr a akýchkoľvek bunkových peliet v pufri. Vysoká čistota izolovanej DNA umožňuje jej použitie na všetky typy analýz.

doba izolácie je 30 až 45 minút v závislosti od počtu vzoriek;

účinná väzba DNA na membránu kolóny umožňuje získať najvyšší výťažok DNA zo vzorky;
vysoký stupeň čistenia je dosiahnutý vďaka optimalizovanému zloženiu zložiek lyzačných a premývacích roztokov;
významne znížila fragmentáciu DNA a stratu počas premývania v porovnaní s inými metódami extrakcie sorbentom;
je možné uskutočniť koncentráciu DNA znížením objemu elučného roztoku;
izolácia DNA na kolónach výrazne znižuje spotrebu ďalšieho plastu;
maximálny objem vzorky - 200 ul;
súprava obsahuje proteinázu K;
čistota izolovanej DNA je 1,8-1,9 podľa pomeru A260/A280;
množstvo izolovanej DNA závisí od typu a množstva vzorky. Výťažok DNA z 200 µl krvi je v priemere 5-6 µg.

Sada reagencií na extrakciu genómovej DNA "DNA-Extran"

Pomocou súprav na extrakciu genómovej DNA série DNA-Extran môžete izolovať DNA z rôznych biologických materiálov: krvi, kultúr bakteriálnych a živočíšnych buniek, čerstvých, mrazených alebo sušených tkanív zvierat a rastlín.

úplná extrakcia DNA z buniek, minimalizujúca stratu a fragmentáciu DNA počas purifikácie;
izolovaná DNA má vysoký stupeňčistota (pomer А260/А280 = 1,8-1,9) a vhodné pre PCR, reštrikčné, hybridizačné a iné štúdie;
súpravy neobsahujú potenciálne nebezpečné zložky ako fenol a chloroform, nevyžadujú veľa plastov a nevytvárajú toxický odpad.

Reagenčná súprava na extrakciu DNA na magnetických časticiach "M-Sorb-Tub"

Prispôsobené na izoláciu DNA mykobaktérií zo spúta, výplachov priedušiek, cerebrospinálneho moku, exsudátu, bodiek, biopsie, moču, sekrétov pohlavného ústrojenstva, bunkových kultúr. Predbežné spracovanie klinického materiálu sa vykonáva v súlade so štandardnými postupmi prípravy vzoriek na mikrobiologické štúdie (Nariadenie č. 109 Ministerstva zdravotníctva Ruskej federácie z 21. marca 2003 „O zlepšení protituberkulóznych opatrení v Ruská federácia“, dodatok 11 „Pokyny o jednotných metódach mikrobiologických štúdií pri zisťovaní, diagnostike a liečbe tuberkulózy“). Na inaktiváciu klinického materiálu odporúčame použiť náš inaktivačný roztok A.

Roztok A zabíja mykobaktérie do 12 hodín a dezinfikuje klinický materiál, ktorý možno použiť na ďalšiu analýzu (extrakcia DNA, PCR atď.). Roztok A je prispôsobený špeciálne na liečbu spúta a úplne nahrádza štandardný postup s použitím roztoku NaOH-NALC, má výnimočné mukolytické vlastnosti. Inaktivačný roztok A zvyšuje výťažok DNA v porovnaní so štandardnou prípravou vzorky NaOH-NALC.

Postup izolácie zahŕňa: lýzu DNA guanidín izotiokyanátom, sorpciu DNA na magnetických časticiach, sedimentáciu DNA centrifugáciou, premývacie kroky a elúciu DNA. Môže sa použiť na izoláciu DNA iných mikroorganizmov.

použitie magnetických častíc potiahnutých silikagélom ako sorbentu je technologicky vyspelejší a pohodlnejší formát v porovnaní s inými sorbentmi, umožňuje maximálnu štandardizáciu a automatizáciu postupu extrakcie DNA;

ku každej testovanej vzorke sa pridá vnútorná pozitívna kontrola (IPC), prítomnosť/neprítomnosť inhibítorov RT-PCR a účinnosť extrakcie DNA sa posúdia podľa IPC amplifikačnej reakcie.

Reagenčné súpravy na extrakciu DNA z potravinárskych produktov a potravinárskych surovín

Reagenčné súpravy "Sorb-GMO-A" a "Sorb-GMO-B" sú navrhnuté špeciálne na extrakciu DNA z rastlinných materiálov, produkty na jedenie a krmivo. Obe súpravy na čistenie DNA používajú silikónový sorbent. "Sorb-GMO-A" obsahuje guanidínchlorid ako lyzačné činidlo, "Sorb-GMO-B" obsahuje iónový detergent STAB, ktorý poskytuje maximálny výťažok DNA z rastlinných zložiek. Charakteristickými vlastnosťami súpravy "Sorb-GMO-A" je rýchlosť extrakcie DNA a absencia chloroformu, vďaka čomu je práca so súpravou bezpečnejšia.

Reagenčná súprava na extrakciu DNA zo vzoriek vody (na magnetických časticiach) "M-Sorb-Leg"

Navrhnuté na izoláciu DNA Legionella z vodných plôch životné prostredie(chladiace veže, bazény, aquaparky, systémy zásobovania teplou a studenou vodou). Minimálna získaná koncentrácia legionelly je 100 buniek na 0,5 l vzorky.

Sada "M-Sorb-Leg" sa vyrába v dvoch modifikáciách: "M-Sorb-Leg1000" pre vzorky vody s objemom 1-1000 ml a "M-Sorb-Leg1" pre vzorky vody do 1 ml. Sada M-Sorb-Leg1000 zabezpečuje filtráciu vody pomocou polykarbonátového filtra.

sada činidiel "M-Sorb-Leg" vám umožňuje zbaviť sa inhibítorov PCR prítomných vo vysoko kontaminovaných vzorkách vody;

Technika izolácie DNA je založená na sorpcii DNA na magnetických časticiach potiahnutých silikagélom, po ktorej nasleduje precipitácia s precipitačným činidlom. Spája výhody sorpčných metód a metódy úhrnných zrážok;
ku každej testovanej vzorke sa pridá vnútorná pozitívna kontrola (IPC) a prítomnosť/neprítomnosť inhibítorov RT-PCR sa posúdi podľa IPC amplifikačnej reakcie.

Sada reagencií na extrakciu DNA z environmentálnych objektov (na magnetických časticiach) "M-Sorb-OOM"

Reagenčná súprava M-Sorb-OOM je určená na izoláciu DNA z environmentálnych objektov (pôda, voda, mŕtvoly zvierat atď.), ktoré sú podozrivé z infekcie vysoko nebezpečnými mikroorganizmami (OOM), s cieľom pripraviť ich na následnú analýzu reálnou časová PCR. Postup extrakcie je podobný ako pri súprave M-Sorb-Leg.

Reagenčná súprava na izoláciu RNA "RNA-Extran"

Súprava je určená na izoláciu RNA z krvi, tkanivových fragmentov, bunkových kultúr. RNA získaná pomocou súpravy RNA-Extran sa môže použiť na RT-PCR aj na hybridizačnú analýzu, in vitro transláciu a klonovanie.

Princíp izolácie RNA je založený na kyslej fenolovej extrakcii podľa Chomchinského, pri ktorej zostáva len RNA vo vodnej fáze a DNA v kombinácii s proteínmi prechádza do organickej fázy. Guanidíntiokyanát sa používa ako činidlo, ktoré izoluje a denaturuje bunkové nukleázy.

umožňuje získať vysoko purifikovanú RNA bez nečistôt DNA;

poskytuje kompletnú extrakciu RNA z celej krvi, tkanivových fragmentov a bunkových kultúr;

umožňuje získať neporušenú RNA;

Čas extrakcie RNA - 1 hodina.

katalógové číslo	titul	počet reakcií
EX-509	Reagenčná súprava “DNA-Extra-1” na izoláciu genómovej DNA z plnej krvi	100
EX-511	Reagenčná súprava “DNA-Extran-2” na extrakciu DNA zo zvieracích a ľudských tkanív	100
EX-512	Reagenčná súprava “DNA-Extran-3” na extrakciu DNA z bakteriálnych kultúr	100
EX-513	Reagenčná súprava “DNA-Extra-4” na extrakciu DNA z rastlinných tkanív	100
EX-514	Reagenčná súprava “K-Sorb” na izoláciu celkovej DNA na kolónach (z krvi, slín, moču, bunkových kultúr, zoškrabov epitelových buniek)	100
EX-515	Reagenčná súprava "RNA-Extra" na izoláciu RNA z krvi, tkanív, bunkových kultúr	50
OM-505	Reagenčná súprava „M-Sorb-Tub“ na extrakciu DNA z klinických vzoriek a bunkových kultúr (na magnetických časticiach)	50 alebo 100
GM-502-50	“SORB-GMO-A” (guanidín + sorbent) Sada činidiel na extrakciu DNA z rastlinných surovín a potravinárskych produktov	50
GM-503-50	“SORB-GMO-B” (CTAB + sorbent) Sada činidiel na extrakciu DNA z rastlinných surovín a potravinárskych produktov	50
OM-506	Reagenčná súprava “M-Sorb-Leg1000” na izoláciu DNA legionel zo vzoriek vody do 1000 ml (na magnetických časticiach, filtre sú dodávané samostatne)	50 alebo 100
OM-507	Reagenčná súprava “M-Sorb-Leg1” na izoláciu DNA legionel zo vzoriek vody do 1 ml (na magnetických časticiach)	50 alebo 100
OOM-502	Reagenčná súprava “M-sorb-OOM” na extrakciu DNA z environmentálnych objektov (na magnetických časticiach)	50 alebo 100

informacie o objednavke

názov	Objem	Výroba	Metóda	Kat.číslo
“GMO-MagnoSorb” (guanidín + magnetický sorbent) Sada činidiel na extrakciu DNA z rastlinných surovín a potravinárskych produktov	50 sekrétov	Synthol	PCR v reálnom čase	GM-505-50
“SORB-GMO-A” (guanidín + sorbent) Sada činidiel na extrakciu DNA z rastlinných surovín a potravinárskych produktov	50	Synthol	PCR v reálnom čase	GM-502-50-50
“SORB-GMO-B” (CTAB + sorbent) Sada činidiel na extrakciu DNA z rastlinných surovín a potravinárskych produktov	50	Synthol	PCR v reálnom čase	GM-503-50-50
Reagenčná súprava „Amplitub-RV“ kit č. 1 („M-Sorb-Tub“) na izoláciu DNA mykobaktérií z klinických vzoriek a bunkových kultúr (na magnetických časticiach)	50	Synthol	PCR v reálnom čase	OM-505
Reagenčná súprava “DNA-Extra-1” na izoláciu genómovej DNA z plnej krvi	100	Synthol	PCR v reálnom čase	EX-509-100
Reagenčná súprava “DNA-Extran-2” na extrakciu DNA zo zvieracích a ľudských tkanív	100	Synthol	PCR v reálnom čase	EX-511
Reagenčná súprava “DNA-Extran-3” na extrakciu DNA z bakteriálnych kultúr	100	Synthol	PCR v reálnom čase	EX-512-100
Reagenčná súprava “DNA-Extran-3” na extrakciu DNA z rastlinných tkanív	100	Synthol	PCR v reálnom čase	EX-513-100
Reagenčná súprava “K-Sorb” na izoláciu celkovej DNA na kolónach (z krvi, slín, moču, bunkových kultúr, zoškrabov epitelových buniek)	100	Synthol	PCR v reálnom čase	EX-514-100
	48 reakcií	Synthol	PCR v reálnom čase	GM-443-48
Súprava skríningových činidiel Sója / 35S+FMV / NOS	50 reakcií	Synthol	PCR v reálnom čase	GM-416-50

"DNA-sorb-S-M" ® AmpliSense FBUN Centrálny výskumný ústav epidemiológie Rospotrebnadzor, Len pre výskum Ruskej federácie, 111123, a na iné nelekárske účely, mesto Moskva, ... “

INŠTRUKCIE

o použití reagenčnej súpravy

na extrakciu DNA z biologického materiálu

"DNA-sorb-S-M"

AmpliSense

Ústredný výskumný ústav epidemiológie FBUN

Rospotrebnadzor,

Len na výskum

Ruská federácia, 111123,

a iné nelekárske účely

Moskva, ulica Novogireevskaya, 3A

ZOZNAM SKRATIEK

ÚČEL

PRINCÍP METÓDY

FORMY BALÍKOV

EXTRAKCIA DNA Z BIOLOGICKÉHO MATERIÁLU ZO ZVIERAT................................... 8

ŽIVOČÍŠNA ALEBO RASTLINNÁ POTRAVA

SYMBOLY POUŽITÉ V TLAČENÝCH PRODUKTOCH

Formulár 1: REF К1-6-50-Mod / VER 27.12.16 / strana 2 z 15

ZOZNAM SKRATIEK

V tomto návode sú použité nasledujúce skratky a symboly:

DNA - deoxyribonukleová kyselina NA - nukleové kyseliny TC - negatívna extrakčná kontrola NCO - negatívna kontrolná vzorka PC - pozitívna extrakčná kontrola PKO - pozitívna kontrolná vzorka PCR - polymerázová reťazová reakcia

– Federálny štátom financovaná organizácia vedy

FBUN CRI

„Ústredný výskumný ústav epidemiológie epidemiológie“ Federálnej služby pre dohľad v oblasti Rospotrebnadzor pre ochranu práv spotrebiteľov a ľudské blaho

ÚČEL

Súprava činidiel "DNA-sorb-S-M" je určená na extrakciu DNA z biologického materiálu zo zvierat: tkanivový (bioptický (koža a sliznice urogenitálneho systému, gastrointestinálneho traktu, priedušiek), chirurgický a pitevný) materiál; a extrakciu DNA z potravín, biologických prísad, krmiva pre zvieratá alebo rastlinných materiálov na následnú analýzu pomocou polymerázovej reťazovej reakcie (PCR).

Extrakcia DNA je preanalytický postup metódy PCR.

Objem vzorky na extrakciu: 100 µl (možno testovať vzorky s objemom 10 až 100 µl alebo hmotnosťou 10 až 100 mg)1.

POZOR! Informácie o postupe odberu, podmienkach prepravy a skladovania testovaného materiálu, potrebe a postupe pri jeho príprave na extrakciu DNA, ako aj informácie o rušivých látkach a obmedzeniach spojených so vzorkou nájdete v návode k použitej súprave amplifikačných činidiel .

PRINCÍP METÓDY

Na testovanú vzorku2 sa pôsobí lyzačným roztokom s proteinázou K, čo vedie k deštrukcii bunkových membrán, uvoľneniu NA a bunkových zložiek. Rozpustené NA sa viažu na častice sorbentu, zatiaľ čo ostatné zložky lyzovaného testovaného materiálu zostávajú v roztoku a sú odstránené, keď sa sorbent vyzráža.V závislosti od testovaného materiálu pozri návod na použitú amplifikačnú súpravu.

Pre niektoré typy biologického materiálu je potrebný krok prípravy vzorky. Cm.

pokyny pre použitú súpravu amplifikačných činidiel.

Forma 1: REF K1-6-50-Mod / VER 27.12.16 / strana 3 z 15 odstredením a následným premytím sorbentu. Keď sa k sorbentu pridá elučný pufor, NC prechádza z povrchu oxidu kremičitého do roztoku, ktorý sa oddelí od častíc sorbentu centrifugáciou. Výsledkom tohto postupu je získanie vysoko purifikovaného prípravku NA bez inhibítorov amplifikačnej reakcie, čo zaisťuje vysokú analytickú citlivosť štúdie PCR.

FORMY BALÍKOV

Súprava reagencií je dostupná v 2 konfiguráciách:

Forma 1 obsahuje súpravu činidiel "DNA-sorb-S-M" verzia 50.

Forma 2 obsahuje súpravu činidiel "DNA-sorb-S-M" verzia 100.

BEZPEČNOSTNÉ OPATRENIA A INFORMÁCIE O LIKVIDÁCII

Pri skúmaní biologického materiálu zo zvierat by sa mala práca vykonávať v súlade s pravidlami Ministerstva poľnohospodárstva Ruskej federácie z 27. januára 1997 č. 13-7-2 / 840 „Pravidlá pre prácu v diagnostických laboratóriách s použitím polymerázy metóda reťazovej reakcie. Základné ustanovenia“ schválené veterinárnym oddelením.

Pri výskume potravín, biologických doplnkových látok, krmív pre zvieratá alebo rastlinných materiálov sa musia vykonávať práce v súlade s požiadavkami usmernenia MU 1.3.2569-09 „Organizácia práce laboratórií pomocou metód amplifikácie nukleových kyselín pri práci s materiálom obsahujúcim mikroorganizmy skupín patogenity I–IV“ a GOST R 53214-2008 „Potravinárske výrobky. Metódy analýzy na zisťovanie geneticky modifikovaných organizmov a produktov z nich odvodených.

Všeobecné požiadavky a definície“.

Pri práci musíte vždy dodržiavať nasledujúce požiadavky:

– Laboratórny proces by mal byť jednosmerný. Analýza sa vykonáva v oddelených miestnostiach (zónach). Práca by mala začať v extrakčnej zóne a pokračovať v zóne zosilnenia a detekcie. Nevracajte vzorky, vybavenie a činidlá do oblasti, kde bol vykonaný predchádzajúci krok procesu.

– Nepoužité reagencie, reagencie po expirácii a Formulár 1: REF K1-6-50-Mod / VER 27.12.16 / strana 4 z 15 použitých reagencií, obal3, biologický materiál vrátane materiálov, nástrojov a predmetov, kontaminovaný biologický materiál je potrebné zlikvidovať v súlade s požiadavkami SanPiN 2.1.7.2790-10 „Sanitárne a epidemiologické požiadavky na nakladanie so zdravotníckym odpadom“.

– Pri každej operácii používajte a vymieňajte jednorazové špičky pre automatické pipety s filtrom4. Jednorazové plastové pomôcky je potrebné vhodiť do špeciálnej nádoby s dezinfekčným prostriedkom, ktorý možno použiť na dekontamináciu medicínskeho odpadu.

– Náčinie (trezory a paličky) a kovové nástroje (skalpely, nožnice, pinzety, nástavce na miešanie atď.) používané na prípravu vzoriek sa uchovávajú v dezinfekčnom roztoku (napríklad 0,2 % roztok sodnej soli kyseliny dichlórizokyanurovej) do jednej hodiny, umyjú sa vodou z vodovodu s povrchovo aktívnou látkou čistiace prostriedky a po umytí v tečúcej a deionizovanej vode sa sušia v suchej sušiarni 4 hodiny pri teplote 180 C.

– Reagenčná súprava je určená pre jednorazové na preštudovanie určeného počtu vzoriek (pozri časť „Zloženie“).

– Reagenčná súprava je pripravená na použitie podľa týchto pokynov.

Reagenčnú súpravu používajte výhradne na určený účel.

– Reagenčnú súpravu nepoužívajte, ak je vnútorný obal poškodený alebo vzhľadčinidlo nezodpovedá popisu.

– Reagenčnú súpravu nepoužívajte, ak neboli dodržané podmienky prepravy a skladovania podľa pokynov.

Nepoužité reagencie, reagencie po expirácii, použité reagencie, obaly sú klasifikované ako zdravotnícky odpad triedy nebezpečnosti G.

Jednorazové špičky bez filtra sa používajú na odstránenie supernatantu počas extrakcie pomocou vákuovej odsávačky.

Formulár 1: REF К1-6-50-Mod / VER 27.12.16 / strana 5 z 15

– Reagenčnú súpravu nepoužívajte po dátume exspirácie.

– Pri manipulácii so vzorkami a činidlami používajte jednorazové bezpudrové rukavice, laboratórne plášte a ochranu očí. Na konci práce si dôkladne umyte ruky. Všetky operácie sa vykonávajú iba v rukaviciach, aby sa zabránilo kontaktu s ľudským telom.

– Zabráňte vdýchnutiu výparov, kontaktu s pokožkou, očami a sliznicami, neprehĺtajte. V prípade kontaktu postihnuté miesto ihneď opláchnite vodou, v prípade potreby vyhľadajte lekársku pomoc. zdravotná starostlivosť.

– Karty bezpečnostných údajov reagencií (KBÚ) sú k dispozícii na vyžiadanie.

Posúdenie pravdepodobných udalostí, v dôsledku ktorých môžu nastať negatívne dôsledky pre ľudský organizmus:

Pri použití na určený účel a dodržaní vyššie uvedených opatrení je vylúčený kontakt s ľudským telom.

V núdzových situáciách je možné:

- podráždenie očnej sliznice u citlivých osôb,

- podráždenie pokožky u citlivých osôb,

- Alergická reakcia,

- poškodenie vdýchnutím,

- poškodenie pri perorálnom podaní.

Špecifické účinky reagenčnej súpravy na ľudský organizmus:

– Bez karcinogénneho účinku.

- Nemá žiadny mutagénny účinok.

– Žiadna reprodukčná toxicita.

DODATOČNÉ MATERIÁLY A VYBAVENIE

(s uvedením výrobcov/dodávateľov):

1. Jednorazové 1,5 ml a 5,0 ml polypropylénové skúmavky so závitom alebo tesnou zátkou (napr. Axygen, Inc.

(Exgen, Inc.), USA alebo ekvivalent).

2. Jednorazové špičky pre pipety s premenlivým objemom s filtrom do 200 a do 1000 µl (napríklad Axygen, Inc. ("Exgen, Inc."), USA alebo podobne).

3. Jednorazové špičky pre pipety s premenlivým objemom do 200 µl (napr. Axygen, Inc. ("Exgen, Inc."), USA alebo podobné).

Formulár 1: REF К1-6-50-Mod / VER 27.12.16 / strana 6 z 15

4. Stojany na skúmavky s objemom 1,5 ml (napríklad Axygen, Inc. ("Exgen, Inc."), USA alebo podobné).

5. Laminárny box, trieda biologickej bezpečnosti II typ A (napríklad "BAVp-01-"Laminar-S"-1.2", CJSC "Laminar Systems", Rusko alebo podobne).

6. Termostat pre skúmavky typu „Eppendorf“ od 25 do 100 °C (napríklad SIA Biosan, Lotyšsko a podobne).

7. Termostatická trepačka pre skúmavky typu Eppendorf od 25 do 100 °C (napríklad TS-100, SIA Biosan, Lotyšsko alebo podobne).

8. Mikrocentrifúga pre skúmavky typu Eppendorf s maximálnou rýchlosťou odstreďovania aspoň 12 000 g (napríklad MiniSpin, Eppendorf ("Eppendorf Manufacturing Corporation"), Manufacturing Corporation Germany alebo podobné).

9. Vortex (napríklad SIA Biosan, Lotyšsko alebo podobne).

10. Lekárska vákuová odsávačka so zachytávacou bankou na odstránenie supernatantu (napríklad OM-1, OOO Utes, Rusko alebo podobne).

11. Automatické dávkovače s premenlivým objemom (napríklad Biohit LLC, Rusko a podobne).

12. Chladnička od 2 do 8 °С s mrazničkou od mínus 24 do mínus 16 С.

13. Samostatný župan, čiapky, obuv a jednorazové rukavice podľa MU 1.3.2569-09.

14.Jednorazové plastové nádoby na uvoľnenie a inaktiváciu materiálov.

– – –

EXTRAKCIA DNA Z BIOLOGICKÉHO MATERIÁLU ZO ZVIERAT

2. Vyberte požadovaný počet jednorazových 1,5 ml polypropylénových skúmaviek so skrutkovacím uzáverom alebo tesne priliehajúcim uzáverom (vrátane negatívnych a pozitívnych extrakčných kontrol, ak sú poskytnuté pre štúdiu PCR).

Pri skladovaní lyzačného tlmivého roztoku a premývacieho roztoku 1 pri teplote 2 až 8 °C sa môže vytvoriť zrazenina vo forme kryštálov.

Formulár 1: REF К1-6-50-Mod / VER 27.12.16 / strana 8 z 15

3. Pridajte 10 µl VKO6 do každej skúmavky (ak je určená na testovanie PCR). Do skúmaviek pridajte 400 µl lyzačného pufra a 17 µl lyzačného pufra.

4. Nadávkujte 100 µl testovacích vzoriek6 do pripravených skúmaviek, pričom pre každú vzorku použite samostatnú filtračnú špičku.

POZOR! 400 µl lyzačného pufra a 17 µl lyzačného činidla je možné pridať do skúmavky s požadovaným množstvom testovanej vzorky a 10 µl BKO7 (ak je k dispozícii pre štúdiu PCR) možno pridať do tej istej skúmavky pomocou samostatných filtračných špičiek.

5. Pridajte 100 µl OKO do skúmavky na extrakciu negatívnej kontroly (TC), pridajte 90 µl OKO a 10 µl FKO do skúmavky na extrakciu s pozitívnou kontrolou (PC) (ak sú k dispozícii kontroly extrakcie na vykonávanie štúdií PCR).6

6. Pevne zatvorte viečka, dôkladne premiešajte a pretrepte kvapky.

Skúmavky vložte na 1 hodinu do termostatu pri teplote 64 °C a pravidelne ich pretrepávajte (5-krát každých 10–12 minút). Inkubácia sa nechá 12 hodín pri 60 °C.

7. Sedimentujte nerozpustené častice vzorky odstreďovaním počas 5 minút pri 10 kg (napr. 12 krpm za minútu pre mikrocentrifúgu MiniSpin, Eppendorf Manufacturing Corporation).

8. Veľmi opatrne odstráňte supernatant v objeme 200-350 µl (zabráňte vniknutiu suspendovaných častíc a kvapiek tuku) pomocou samostatných špičiek s filtrami a preneste do nových skúmaviek. Usadzovanie kvapiek na vortexe.

9. Resuspendujte univerzálny sorbent intenzívnym miešaním na vortexe. Pridajte 25 µl resuspendovaného univerzálneho sorbentu do každej skúmavky samostatnou špičkou, pevne zatvorte viečka.

Vortexujte, nechajte na stojane 10 minút a každé 2 minúty premiešajte.

Je povolené meniť objem testovacích a kontrolných vzoriek, pozri návod na použitie súpravy amplifikačných činidiel.

Formulár 1: REF К1-6-50-Mod / VER 27.12.16 / strana 9 z 15

18. Zopakujte postup umývania podľa nasledujúcich odsekov. 15–16 úplne odstráňte supernatant.

19. Skúmavky s otvorenými viečkami vložte do termostatu pri 64 °C na 5–10 minút, aby sa univerzálny sorbent vysušil.

20. Pridajte 50–100 µl elučného pufra B do skúmaviek (pozrite si pokyny pre použitú súpravu amplifikačných činidiel).

Vortexujte, kým sa sorbent úplne nerozsuspenduje. Vložte do termostatu s teplotou 64 °C na 5–10 minút, pravidelne (1 krát za minútu) miešajte na vortexe.

Purifikovanú DNA možno skladovať pri teplote 2 až 8 °C týždeň, pri teplote mínus 24 až mínus 16 °C 6 mesiacov a pri teplote nepresahujúcej mínus 68 °C rok. Na to je potrebné, bez zachytenia sorbentu, preniesť supernatant do novej skúmavky.

Formulár 1: REF К1-6-50-Mod / VER 27.12.16 / strana 10 z 15

EXTRAKCIA DNA Z POTRAVÍN, BIOLOGICKÉ DOPLNKY,

ŽIVOČÍŠNA ALEBO RASTLINNÁ POTRAVA

POZOR! Postup prípravy biologického materiálu na extrakciu DNA a objem testovanej vzorky nájdete v pokynoch pre reagenčnú súpravu použitú na amplifikáciu

1. Zahrejte lyzačný pufor a premývací roztok 1, ak sú skladované pri teplote 2 až 8 °C, pri teplote 64 °C, kým sa kryštály úplne nerozpustia.

2. Umiestnite 1,5 ml skúmavky s vopred upravenými testovacími vzorkami do stojana (pozrite si pokyny pre súpravu amplifikačných činidiel použitú pre objem/množstvo vzorky).

3. Pripravte si jednorazovú 1,5 ml polypropylénovú skúmavku so skrutkovacím uzáverom alebo tesne priliehajúcu negatívnu extrakčnú kontrolu (EC). Pridajte 100 µl OKO do skúmavky.

4. Pridajte 400 µl lyzačného pufra a 17 µl lyzačného činidla do skúmaviek a OC.

5. Pevne zatvorte viečka, dôkladne premiešajte a pretrepte kvapky.

Skúmavky vložte na 1 hodinu do termostatu pri teplote 64 °C, pravidelne ich premiešajte (5-krát každých 10–12 minút) alebo použite trepačku s termostatom.

6. Sedimentujte nerozpustené častice vzorky odstredením počas 5 minút pri 10 kg (napr. 12 krpm za minútu pre mikrocentrifúgu MiniSpin, Eppendorf Manufacturing Corporation).

7. Vyberte požadovaný počet nových jednorazových 1,5 ml polypropylénových skúmaviek so skrutkovacím uzáverom alebo tesne priliehajúcim uzáverom.

8. Resuspendujte univerzálny sorbent intenzívnym miešaním na vortexe. Pridajte 25 µl resuspendovaného univerzálneho sorbentu do každej skúmavky samostatnou špičkou, pevne zatvorte viečka.

9. Zo skúmaviek s lýzovanými vzorkami veľmi opatrne odstráňte supernatant v objeme 200 – 350 µl (zabráňte vniknutiu suspendovaných častíc a kvapiek tuku) pomocou samostatných špičiek s filtrami a preneste do skúmaviek so sorbentom. Vortexujte, nechajte na stojane 10 minút a každé 2 minúty premiešajte.

Formulár 1: REF К1-6-50-Mod / VER 27.12.16 / strana 11 z 15

10. Odstreďujte skúmavky v mikrocentrifúge 1 minútu pri 2 kg (napr. 5 krpm za minútu pre mikrocentrifúgu MiniSpin, Eppendorf Manufacturing Corporation).

11. Bez uchopenia sorbentu odstráňte supernatant z každej skúmavky samostatnou 200 µl špičkou bez filtra pomocou vákuovej odsávačky.

12. Pridajte 300 µl premývacieho roztoku 1 do skúmaviek, pevne uzavrite viečka a vortexujte, kým sa univerzálny sorbent úplne nerozsuspenduje.

13. Odstreďujte skúmavky v mikrocentrifúge 1 minútu pri 2 000 g.

14. Bez uchopenia sorbentu odstráňte supernatant z každej skúmavky samostatnou 200 µl špičkou bez filtra pomocou vákuovej odsávačky.

15. Pridajte 500 µl premývacieho roztoku 2 do skúmaviek, pevne uzavrite viečka, premiešajte na vortexe, kým sa univerzálny sorbent úplne nerozsuspenduje.

16. Odstreďujte skúmavky v mikrocentrifúge počas 1 minúty pri 7 kg (napr. 10 krpm za minútu pre mikrocentrifúgu MiniSpin, Eppendorf Manufacturing Corporation).

17. Bez uchopenia sorbentu odstráňte supernatant z každej skúmavky samostatnou 200 µl špičkou bez filtra pomocou vákuovej odsávačky.

18. Zopakujte postup umývania podľa nasledujúcich odsekov. 15-16 úplne odstráňte supernatant.

19. Skúmavky s otvorenými viečkami vložíme na 5-10 minút do termostatu s teplotou 64 °C, aby sa univerzálny sorbent vysušil.

20. Do skúmaviek pridajte 50 µl elučného pufra B. Vortexujte, kým sa sorbent úplne nerozsuspenduje. Vložte do termostatu s teplotou 64 °C na 5–10 minút, pravidelne (1 krát za minútu) miešajte na vortexe.

21. Skúmavky centrifugujte v mikrocentrifúge 1 min pri 10 000 g. Supernatant obsahuje purifikovanú DNA. Vzorky sú pripravené na PCR.

Purifikovanú DNA možno skladovať pri teplote 2 až 8 °C týždeň, pri teplote -24 až -16 °C 6 mesiacov a pri teplote Form 1: REF K1-6-50-Mod / VER 27.12 .16 / strana 12 z 15 nie vyššia ako mínus 68 °С počas roka. Na to je potrebné, bez zachytenia sorbentu, preniesť supernatant do novej skúmavky.

DÁTUM EXPIRÁCIE, PODMIENKY PREPRAVY A SKLADOVANIA.

Dátum minimálnej trvanlivosti. 12 mesiacov Reagenčná súprava po expirácii by sa nemala používať. Dátum exspirácie otvorených reagencií je dátum exspirácie na štítkoch pre neotvorené reagencie, pokiaľ nie je v pokynoch uvedené inak.

Doprava. Súprava činidiel by sa mala prepravovať pri teplote 2 až 8 C najviac 5 dní v termonádobách s ľadovými obalmi všetkými typmi krytých vozidiel. Po prijatí rozložte podľa uvedených skladovacích teplôt.

Skladovanie. Reagenčnú súpravu skladujte pri teplote 2 až 25 C, okrem lyzačného činidla. Lyzačné činidlo uchovávajte v chladničke pri teplote 2 až 8 C.

Chladiace komory musia poskytovať regulovaný teplotný režim.

lyzačný roztok 30 cm 3 ,

Prací roztok 1 30 cm 3 ,

Koncentrát na čistiaci roztok 2 20 cm 3 ,

Sorpčná suspenzia 2 cm 3,

DNA elučný pufor 4 cm3.

Operačný postup:

Pripravte premývací roztok 2, na tento účel zmiešajte 20 cm 3 koncentrátu zo súpravy, 80 cm 3 destilovanej vody a 100 cm3 96 % etanolu v samostatnej fľaši. Roztok skladujte na izbová teplota v tesne priskrutkovanej fľaši.

Skontrolujte stav sorbentu – pri usadzovaní by mal zaberať približne polovicu objemu suspenzie.

Do tesne uzavretej 1,5 cm 3 polypropylénovej skúmavky (najlepšie so skrutkovacím uzáverom) pridajte 100 µl predtým pripravenej testovacej vzorky, negatívnej alebo pozitívnej, pridajte 300 µl lyzačného roztoku (ku každej vzorke samostatnou špičkou) a dôkladne premiešajte. pipetovať 3-10 krát.

Pridajte 15 - 20 µl resuspendovaného sorbentu, dobre premiešajte na vortexe, vložte do stojana na 5-7 minút, aby sa sorbent úplne usadil.

Sedimentujte sorbent v mikrocentrifúge po dobu 30 sekúnd pri 3-8 tisíc ot./min. Z každej skúmavky odoberte supernatant samostatnou špičkou (vhodné je použiť vákuové odsávanie).

Pridajte 300 μl premývacieho roztoku 1, miešajte na vortexe, kým sa sorbent úplne nerozsuspenduje (ak sa sorbent zle rozbije, rozbite ho pipetou), zrážajte v odstredivke pri 4-8 tisíc ot./min. počas 30 sekúnd. Odoberte supernatant z každej skúmavky samostatnou špičkou.

Pridajte 800 μl premývacieho roztoku 2, premiešajte na vortexe, kým sa sorbent úplne nerozsuspenduje, zrážajte na mikrocentrifúge pri 6-10 000 ot./min. počas 30 sekúnd, odoberte supernatant.

Opakujte krok 6, opatrne vyberte supernatant, vysušte zrazeninu sorbentu v termostate pri 65 °C počas 5 minút.

Resuspendujte sorbent v 30-40 µl elučného tlmivého roztoku, umiestnite ho do termostatu pri 65 °C na 5 minút, pravidelne ho premiešajte na vortexe.

Sedimentujte na mikrocentrifúge pri maximálnej rýchlosti 1 min.

Vzorka je pripravená na PCR, supernatant obsahuje purifikovanú DNA.

Ako negatívnu kontrolu v štádiu extrakcie DNA je potrebné použiť fyziologický roztok alebo deionizovanú vodu.

Účinnosť extrakcie DNA pomocou súpravy DNA-sorb-PCR je 30–60 %.

klinický materiál	Plazma, sérum	Škrabanie, sperma, výplachy hltana, moč	Biopsia, krv, výkaly
Počet pipetovaní
Objem sorbentu
Rýchlosť usadzovania sorbentu	8 tisíc otáčok za minútu	6 tisíc otáčok za minútu	3-4 tisíc otáčok za minútu
Objem eluentu
Účinnosť extrakcie DNA

5.2. Fáza 2. Zloženie zostavy PCR súpravy na amplifikáciu PCR:

5x reakčný pufor. 1000 µl (viskózna číry modrý roztok)

Deionizovaná voda. 2000 ul

Zmes nukleotidov. 500 ul

Taq polymeráza.100 ul

Základná zmes. 500 µl

Vosk pre PCR. 2000 ul

Pozitívna kontrola, 100 ul

Negatívna kontrola 100 ul

Minerálny olej 4000 µl

Súprava sa skladuje jeden rok pri teplote mínus 20 °C.