Методът за бърза ДНК екстракция с микроколона е предназначен да изолира общата ДНК от кръв, плазма, слюнка, урина, клетъчни култури и всякакви клетъчни пелети в буфер. Високата чистота на изолираната ДНК позволява да се използва за всички видове анализи.

времето за изолиране е от 30 до 45 минути в зависимост от броя на пробите;

ефективното свързване на ДНК към мембраната на колоната позволява получаване на най-висок добив на ДНК от пробата;
висока степен на пречистване се постига благодарение на оптимизирания състав на компонентите на лизиращите и промивните разтвори;
значително намалена фрагментация и загуба на ДНК по време на измиване в сравнение с други методи за екстракция със сорбент;
възможно е да се извърши концентрация на ДНК чрез намаляване на обема на елуиращия разтвор;
изолирането на ДНК върху колоните значително намалява потреблението на допълнителна пластмаса;
максимален обем на пробата - 200 µl;
комплектът съдържа протеиназа К;
чистотата на изолираната ДНК е 1,8-1,9 според съотношението А260/А280;
количеството изолирана ДНК зависи от вида и количеството на пробата. Добивът на ДНК от 200 µl кръв е средно 5-6 µg.

Комплект реактиви за екстракция на геномна ДНК "ДНК-Екстран"

Използвайки комплекти за извличане на геномна ДНК от серията DNA-Extran, можете да изолирате ДНК от различни биологични материали: кръв, култури от бактериални и животински клетки, пресни, замразени или изсушени тъкани от животни и растения.

пълно извличане на ДНК от клетките, минимизиране на загубата и фрагментацията на ДНК по време на пречистването;
изолираната ДНК има високо нивочистота (съотношение А260/А280 = 1.8-1.9) и подходящ за PCR, рестрикция, хибридизация и други изследвания;
комплектите не съдържат потенциално опасни компоненти като фенол и хлороформ, не изискват много пластмаса и не генерират токсични отпадъци.

Комплект реактиви за екстракция на ДНК върху магнитни частици "M-Sorb-Tub"

Адаптиран за изолиране на ДНК на микобактерии от храчка, бронхиални промивки, цереброспинална течност, ексудат, пунктат, биопсия, урина, секрети от гениталния тракт, клетъчни култури. Предварителната обработка на клиничния материал се извършва в съответствие със стандартните процедури за подготовка на проби за микробиологични изследвания (Заповед № 109 на Министерството на здравеопазването на Руската федерация от 21 март 2003 г. „За подобряване на противотуберкулозните мерки в Руска федерация", Приложение 11 „Инструкция за унифицирани методи за микробиологични изследвания при откриване, диагностика и лечение на туберкулоза"). За да инактивирате клиничния материал, препоръчваме да използвате нашия инактивиращ разтвор A.

Разтвор А убива микобактериите в рамките на 12 часа и дезинфекцира клиничния материал, който може да се използва за по-нататъшен анализ (екстракция на ДНК, PCR и др.). Разтвор А е адаптиран специално за лечение на храчки и напълно замества стандартната процедура с използване на разтвор на NaOH-NALC, има изключителни муколитични свойства. Разтвор за инактивиране А увеличава добива на ДНК в сравнение със стандартната подготовка на проби с NaOH-NALC.

Процедурата за изолиране включва: лизиране на ДНК с гуанидин изотиоцианат, сорбция на ДНК върху магнитни частици, утаяване на ДНК чрез центрофугиране, етапи на промиване и елуиране на ДНК. Може да се използва за изолиране на ДНК на други микроорганизми.

използването на магнитни частици, покрити със силикагел като сорбент, е по-технологично усъвършенстван и удобен формат в сравнение с други сорбенти, позволява максимална стандартизация и автоматизация на процедурата за извличане на ДНК;

вътрешна положителна контрола (IPC) се добавя към всяка тестова проба, наличието/отсъствието на инхибитори на RT-PCR и ефективността на екстракцията на ДНК се оценяват чрез реакцията на IPC амплификация.

Комплекти реагенти за извличане на ДНК от хранителни продукти и хранителни суровини

Комплектите реактиви "Sorb-GMO-A" и "Sorb-GMO-B" са предназначени специално за извличане на ДНК от растителни материали, хранителни продуктии фураж. И двата комплекта за пречистване на ДНК използват силициев сорбент. "Sorb-GMO-A" съдържа гуанидин хлорид като лизиращ агент, "Sorb-GMO-B" съдържа йонен детергент STAB, който осигурява максимален добив на ДНК от растителни компоненти. Отличителни черти на комплекта "Sorb-GMO-A" са скоростта на извличане на ДНК и липсата на хлороформ, което прави работата с комплекта по-безопасна.

Комплект реактиви за извличане на ДНК от водни проби (на магнитни частици) "M-Sorb-Leg"

Проектиран да изолира ДНК на Legionella от водни тела околен свят(охладителни кули, плувни басейни, аквапаркове, системи за топла и студена вода). Минималната възстановена концентрация на Legionella е 100 клетки на 0,5 L проба.

Комплектът "M-Sorb-Leg" се произвежда в две модификации: "M-Sorb-Leg1000" за водни проби с обем 1-1000 ml и "M-Sorb-Leg1" за водни проби до 1 ml. Комплектът M-Sorb-Leg1000 осигурява филтриране на вода с поликарбонатен филтър.

набор от реагенти "M-Sorb-Leg" ви позволява да се отървете от PCR инхибиторите, присъстващи в силно замърсени водни проби;

Техниката за екстракция на ДНК се основава на сорбция на ДНК върху покрити със силициев диоксид магнитни частици, последвано от утаяване с утаяващ реагент. Съчетава предимствата на сорбционните методи и метода на тоталното утаяване;
вътрешна положителна контрола (IPC) се добавя към всяка тестова проба, наличието/отсъствието на RT-PCR инхибитори се преценява чрез реакцията на IPC амплификация.

Комплект реактиви за извличане на ДНК от обекти на околната среда (на магнитни частици) "М-Сорб-ООМ"

Комплектът реагент M-Sorb-OOM е предназначен за изолиране на ДНК от обекти на околната среда (почва, вода, животински трупове и др.), за които има съмнение, че са заразени с изключително опасни микроорганизми (OOM), с цел подготовката им за последващ анализ чрез реални време PCR. Процедурата за извличане е подобна на описаната за комплекта M-Sorb-Leg.

Комплект реактиви за изолиране на РНК "RNA-Extran"

Комплектът е предназначен за изолиране на РНК от кръв, тъканни фрагменти, клетъчни култури. РНК, получена с помощта на комплекта RNA-Extran, може да се използва както за RT-PCR, така и за хибридизационен анализ, in vitro транслация и клониране.

Принципът на изолиране на РНК се основава на екстракция с кисели феноли по Чомчински, при която само РНК остава във водната фаза, а ДНК в комбинация с протеини преминава в органичната фаза. Гуанидин тиоцианатът се използва като агент, който изолира и денатурира клетъчните нуклеази.

позволява да се получи високо пречистена РНК, свободна от ДНК примеси;

осигурява пълно извличане на РНК от цяла кръв, тъканни фрагменти и клетъчни култури;

ви позволява да получите непокътната РНК;

Време за екстракция на РНК - 1 час.

Каталожен номер	заглавие	брой реакции
EX-509	Комплект реактиви “ДНК-Екстра-1” за изолиране на геномна ДНК от цяла кръв	100
EX-511	Комплект реактиви “ДНК-Екстран-2” за извличане на ДНК от животински и човешки тъкани	100
EX-512	Комплект реактиви “ДНК-Екстран-3” за извличане на ДНК от бактериални култури	100
EX-513	Комплект реактиви “ДНК-Екстра-4” за извличане на ДНК от растителни тъкани	100
EX-514	Комплект реактиви “K-Sorb” за изолиране на тотална ДНК върху колони (от кръв, слюнка, урина, клетъчни култури, изстъргвания от епителни клетки)	100
EX-515	Комплект реактиви "RNA-Extra" за изолиране на РНК от кръв, тъкани, клетъчни култури	50
OM-505	Комплект реактиви “M-Sorb-Tub” за извличане на ДНК от клинични проби и клетъчни култури (на магнитни частици)	50 или 100
GM-502-50	“SORB-GMO-A” (гуанидин + сорбент) Комплект реактиви за извличане на ДНК от растителни суровини и хранителни продукти	50
GM-503-50	“SORB-GMO-B” (CTAB + сорбент) Комплект реактиви за извличане на ДНК от растителни суровини и хранителни продукти	50
OM-506	Комплект реактиви “M-Sorb-Leg1000” за изолиране на ДНК на легионела от водни проби до 1000 ml (за магнитни частици филтрите се доставят отделно)	50 или 100
OM-507	Комплект реактиви “M-Sorb-Leg1” за изолиране на ДНК на легионела от водни проби до 1 ml (на магнитни частици)	50 или 100
ООМ-502	Комплект реактиви “М-сорб-ООМ” за извличане на ДНК от обекти на околната среда (на магнитни частици)	50 или 100

информация за поръчка

Име	Сила на звука	производство	Метод	Кат.номер
“GMO-MagnoSorb” (гуанидин + магнитен сорбент) Комплект реактиви за извличане на ДНК от растителни суровини и хранителни продукти	50 секрети	Синтол	PCR в реално време	GM-505-50
“SORB-GMO-A” (гуанидин + сорбент) Комплект реактиви за извличане на ДНК от растителни суровини и хранителни продукти	50	Синтол	PCR в реално време	GM-502-50-50
“SORB-GMO-B” (CTAB + сорбент) Комплект реактиви за извличане на ДНК от растителни суровини и хранителни продукти	50	Синтол	PCR в реално време	GM-503-50-50
Комплект реактиви “Amplitub-RV” кит № 1 (“M-Sorb-Tub“) за изолиране на ДНК на микобактерии от клинични проби и клетъчни култури (на магнитни частици)	50	Синтол	PCR в реално време	OM-505
Комплект реактиви “ДНК-Екстра-1” за изолиране на геномна ДНК от цяла кръв	100	Синтол	PCR в реално време	EX-509-100
Комплект реактиви “ДНК-Екстран-2” за извличане на ДНК от животински и човешки тъкани	100	Синтол	PCR в реално време	EX-511
Комплект реактиви “ДНК-Екстран-3” за извличане на ДНК от бактериални култури	100	Синтол	PCR в реално време	EX-512-100
Комплект реактиви “ДНК-Екстран-3” за извличане на ДНК от растителни тъкани	100	Синтол	PCR в реално време	EX-513-100
Комплект реактиви “K-Sorb” за изолиране на тотална ДНК върху колони (от кръв, слюнка, урина, клетъчни култури, изстъргвания от епителни клетки)	100	Синтол	PCR в реално време	EX-514-100
	48 реакции	Синтол	PCR в реално време	GM-443-48
Соя / 35S+FMV / NOS комплект реактиви за скрининг	50 реакции	Синтол	PCR в реално време	GM-416-50

"DNA-sorb-S-M" ® AmpliSense FBUN Централен изследователски институт по епидемиология на Роспотребнадзор, Само за изследвания Руска федерация, 111123, и други немедицински цели, град Москва, ... "

ИНСТРУКЦИИ

относно използването на комплекта реактиви

за извличане на ДНК от биологичен материал

"ДНК-сорб-S-M"

AmpliSense

Централен изследователски институт по епидемиология на FBUN

Роспотребнадзор,

Само за изследване

Руска федерация, 111123,

и други немедицински цели

Москва, улица Новогиреевская, 3А

СПИСЪК НА СЪКРАЩЕНИЯТА

ПРЕДНАЗНАЧЕНИЕ

ПРИНЦИП НА МЕТОДА

ФОРМИ ЗА ОПАКОВКИ

ЕКСТРАКЦИЯ НА ДНК ОТ БИОЛОГИЧЕН МАТЕРИАЛ ОТ ЖИВОТНИ.................................. 8

ХРАНА ЗА ЖИВОТНИ ИЛИ РАСТИТЕЛНА ХРАНА

СИМВОЛИ, ИЗПОЛЗВАНИ В ПЕЧАТНИ ПРОДУКТИ

Формуляр 1: REF К1-6-50-Mod / VER 27.12.16 / страница 2 от 15

СПИСЪК НА СЪКРАЩЕНИЯТА

В това ръководство се използват следните съкращения и символи:

ДНК - дезоксирибонуклеинова киселина NA - нуклеинови киселини TC - отрицателна екстракционна контрола NCO - отрицателна контролна проба PC - положителна екстракционна контрола PKO - положителна контролна проба PCR - полимеразна верижна реакция

- Федерален финансирана от държавата организациянаука

FBUN CRI

"Централен изследователски институт по епидемиология на епидемиологията" на Федералната служба за надзор в сферата на Роспотребнадзор за защита на правата на потребителите и благосъстоянието на хората

ПРЕДНАЗНАЧЕНИЕ

Комплектът реактиви "ДНК-сорб-С-М" е предназначен за извличане на ДНК от биологичен материал от животни: тъканен (биоптичен (кожа и лигавици на пикочно-половата система, стомашно-чревния тракт, бронхи), хирургичен и аутопсионен) материал; и извличане на ДНК от храна, биологични добавки, храна за животни или растителни материали за последващ анализ чрез полимеразна верижна реакция (PCR).

Екстракцията на ДНК е преаналитична процедура на PCR метода.

Обем на пробата за екстракция: 100 µl (могат да се тестват проби с обем от 10 до 100 µl или тегло от 10 до 100 mg)1.

ВНИМАНИЕ! За информация относно процедурата за събиране, условията за транспортиране и съхранение на тестовия материал, необходимостта и процедурата за подготовката му за извличане на ДНК, както и информация относно смущаващи вещества и ограничения, свързани с пробата, вижте инструкциите за използвания комплект реагент за амплификация .

ПРИНЦИП НА МЕТОДА

Тестовата проба2 се третира с лизиращ разтвор с протеиназа К, което води до разрушаване на клетъчните мембрани, освобождаване на NA и клетъчни компоненти. Разтворените NAs се свързват с частиците на сорбента, докато другите компоненти на лизирания тестов материал остават в разтвора и се отстраняват, когато сорбентът се утаи.В зависимост от тестовия материал вижте инструкциите за използвания комплект за усилване.

За някои видове биологичен материал се изисква етап на подготовка на пробата. См.

инструкции за използвания комплект реагент за усилване.

Форма 1: REF K1-6-50-Mod / VER 27.12.16 / страница 3 от 15 чрез центрофугиране и последващо промиване на сорбента. Когато елуиращият буфер се добави към сорбента, NC преминава от повърхността на силициевия диоксид в разтвора, който се отделя от частиците на сорбента чрез центрофугиране. В резултат на тази процедура се получава високопречистен препарат на NA, свободен от инхибитори на реакцията на амплификация, което осигурява висока аналитична чувствителност на PCR изследването.

ФОРМИ ЗА ОПАКОВКИ

Комплектът реагент се предлага в 2 конфигурации:

Форма 1 включва набор от реактиви "ДНК-сорб-S-M" версия 50.

Форма 2 включва набор от реактиви "ДНК-сорб-S-M" версия 100.

ПРЕДПАЗНИ МЕРКИ ЗА БЕЗОПАСНОСТ И ИНФОРМАЦИЯ ЗА ИЗХВЪРЛЯНЕ

При изследване на биологичен материал от животни работата трябва да се извършва в съответствие с правилата на Министерството на земеделието на Руската федерация от 27 януари 1997 г. № 13-7-2 / 840 „Правила за работа в диагностични лаборатории, използващи полимераза метод на верижна реакция. Основни положения”, одобрени от Ветеринарния отдел.

При изследване на храни, биологични добавки, храни за животни или растителни материали работата трябва да се извършва в съответствие с изискванията насоки MU 1.3.2569-09 „Организация на работата на лаборатории, използващи методи за амплификация на нуклеинова киселина при работа с материал, съдържащ микроорганизми от групи на патогенност I–IV“ и GOST R 53214-2008 „Хранителни продукти. Методи за анализ за откриване на генетично модифицирани организми и продукти, получени от тях.

Общи изисквания и определения”.

Когато работите, винаги трябва да спазвате следните изисквания:

– Лабораторният процес трябва да е еднопосочен. Анализът се извършва в отделни помещения (зони). Работата трябва да започне в зоната за екстракция и да продължи в зоната за усилване и детекция. Не връщайте проби, оборудване и реагенти в зоната, където е извършена предишната стъпка на процеса.

– Неизползвани реагенти, реактиви с изтекъл срок на годност и Формуляр 1: REF K1-6-50-Mod / VER 27.12.16 / страница 4 от 15 използвани реагенти, опаковки3, биологичен материал, включително материали, инструменти и предмети, замърсеният биологичен материал трябва да се изхвърли в съответствие с изискванията на SanPiN 2.1.7.2790-10 "Санитарни и епидемиологични изисквания за управление на медицински отпадъци".

– Използвайте и сменяйте при всяка операция еднократни накрайници за автоматични пипети с филтър4. Еднократните пластмасови съдове трябва да се изхвърлят в специален контейнер, съдържащ дезинфектант, който може да се използва за обеззаразяване на медицински отпадъци.

– Прибори (хаванчета и пестици) и метални инструменти (скалпели, ножици, пинсети, приставки за блендер и др.), използвани за подготовка на пробата, се държат в дезинфекционен разтвор (например 0,2% разтвор на натриева сол на дихлороизоциануровата киселина) в рамките на един час, измити с чешмяна вода с ПАВ перилни препаратии след измиване в течаща и дейонизирана вода се сушат в суха сушилня за 4 часа при температура 180 С.

– Комплектът реактиви е предназначен за разполагаемза изследване на определения брой проби (вижте раздел „Състав“).

– Комплектът реагент е готов за употреба съгласно тези инструкции.

Използвайте комплекта реагенти стриктно по предназначение.

– Не използвайте комплекта реактиви, ако вътрешната опаковка е счупена или външен видреактивът не отговаря на описанието.

– Не използвайте комплекта реактиви, ако не са спазени условията за транспортиране и съхранение съгласно инструкциите.

Неизползваните реагенти, реагентите с изтекъл срок на годност, използваните реактиви, опаковките се класифицират като медицински отпадъци, клас на опасност G.

Еднократните накрайници без филтър се използват за отстраняване на супернатанта по време на екстракция с вакуум аспиратор.

Формуляр 1: REF К1-6-50-Mod / VER 27.12.16 / страница 5 от 15

– Не използвайте комплекта реагент след изтичане на срока на годност.

– Използвайте ръкавици за еднократна употреба без пудра, лабораторни престилки и предпазни очила, когато работите с проби и реактиви. Измийте добре ръцете в края на работа. Всички операции се извършват само с ръкавици, за да се избегне контакт с човешкото тяло.

– Избягвайте вдишване на парите, контакт с кожата, очите и лигавиците, не поглъщайте. В случай на контакт, незабавно промийте засегнатата област с вода, ако е необходимо, потърсете лекарска помощ. медицински грижи.

– Информационните листове за безопасност на реагентите (SDS) се предоставят при поискване.

Оценка на вероятни събития, в резултат на които могат да възникнат негативни последици за човешкото тяло:

Когато се използва по предназначение и при спазване на горните предпазни мерки, контактът с човешкото тяло е изключен.

При извънредни ситуации е възможно следното:

- дразнене на лигавицата на очите при чувствителни лица,

– дразнене на кожата при чувствителни хора,

- алергична реакция,

- увреждане при вдишване,

- увреждане при перорален прием.

Специфични ефекти на комплекта реактиви върху човешкото тяло:

– Без канцерогенен ефект.

- Няма мутагенен ефект.

– Без репродуктивна токсичност.

ДОПЪЛНИТЕЛНИ МАТЕРИАЛИ И ОБОРУДВАНЕ

(с посочване на производители/доставчици):

1. Еднократни 1,5 ml и 5,0 ml полипропиленови епруветки с винт или плътна запушалка (напр. Axygen, Inc.

(Exgen, Inc.), САЩ или еквивалент).

2. Еднократни накрайници за пипети с променлив обем с филтър до 200 и до 1000 µl (например Axygen, Inc. ("Exgen, Inc."), САЩ, или подобни).

3. Накрайници за еднократна употреба за пипети с променлив обем до 200 µl (напр. Axygen, Inc. ("Exgen, Inc."), САЩ или подобни).

Формуляр 1: REF К1-6-50-Mod / VER 27.12.16 / страница 6 от 15

4. Стойки за епруветки от 1,5 ml (например Axygen, Inc. („Exgen, Inc.“), САЩ или подобни).

5. Ламинарна кутия, клас на биологична безопасност II тип А (например "БАВп-01-"Ламинар-С"-1.2", ЗАО "Ламинарные системы", Русия или подобен).

6. Термостат за тръби тип "Eppendorf" от 25 до 100 °C (например SIA Biosan, Латвия или подобен).

7. Термостат-шейкър за епруветки тип Eppendorf от 25 до 100 °C (например TS-100, SIA Biosan, Латвия или подобни).

8. Микроцентрофуга за епруветки тип Eppendorf с максимална скорост на центрофугиране най-малко 12 хиляди g (например MiniSpin, Eppendorf („Eppendorf Manufacturing Corporation“), Manufacturing Corporation Germany или подобни).

9. Vortex (например SIA Biosan, Латвия или подобен).

10. Медицински вакуум аспиратор с колба-уловител за отстраняване на супернатанта (например OM-1, OOO Utes, Русия или подобен).

11. Автоматични дозатори с променлив обем (например Biohit LLC, Русия или подобни).

12. Хладилник от 2 до 8 °С с фризер от минус 24 до минус 16 С.

13. Отделен халат, шапки, обувки и ръкавици за еднократна употреба съгласно MU 1.3.2569-09.

14. Еднократна употреба пластмасови контейнериза освобождаване и инактивиране на материали.

– – –

ИЗВЛЕЧВАНЕ НА ДНК ОТ БИОЛОГИЧЕН МАТЕРИАЛ ОТ ЖИВОТНИ

2. Изберете необходимия брой полипропиленови епруветки за еднократна употреба от 1,5 ml с капачки на винт или плътно прилепващи капачки (включително отрицателни и положителни екстракционни контроли, ако са предоставени за PCR изследването).

При съхранение на лизиращия буфер и промивния разтвор 1 при температура от 2 до 8°C може да се образува утайка под формата на кристали.

Формуляр 1: REF К1-6-50-Mod / VER 27.12.16 / страница 8 от 15

3. Добавете 10 µl VKO6 към всяка епруветка (ако е предвидена за PCR тестване). Добавете 400 µl лизиращ буфер и 17 µl лизиращ буфер към епруветките.

4. Разпределете 100 µl тестови проби6 в подготвени епруветки, като използвате отделен филтърен накрайник за всяка проба.

ВНИМАНИЕ! 400 µl лизиращ буфер и 17 µl лизиращ реагент могат да бъдат добавени към епруветката с необходимото количество тестова проба и 10 µl BKO7 (ако е предвиден за PCR изследването) могат да бъдат добавени към същата епруветка с помощта на отделни филтърни накрайници.

5. Добавете 100 µl OKO към епруветката за екстракция на отрицателната контрола (TC), добавете 90 µl OKO и 10 µl FKO към епруветката за екстракция на положителната контрола (PC) (ако са предоставени контроли за екстракция за провеждане на PCR изследвания).6

6. Затворете плътно капаците, разбъркайте добре и разбъркайте капките на вортекс.

Поставете епруветките в термостат при 64°C за 1 час, като периодично разбърквате (5 пъти на всеки 10–12 минути). Инкубацията се оставя за 12 часа при 60 °C.

7. Утаете неразтворените частици на пробата чрез центрофугиране за 5 минути при 10 kg (напр. 12 krpm за микроцентрофуга MiniSpin, Eppendorf Manufacturing Corporation).

8. Отстранете супернатантата в обем от 200-350 µl много внимателно (като избягвате навлизането на суспендирани частици и мастни капки) с отделни накрайници с филтри и прехвърлете в нови епруветки. Утаяване на капките върху вихъра.

9. Ресуспендирайте универсалния сорбент чрез интензивно разбъркване на вортекс. Добавете 25 µl ресуспендиран универсален сорбент към всяка епруветка с отделен накрайник, затворете плътно капаците.

Vortex, оставете в решетка за 10 минути, като разбърквате на всеки 2 минути.

Разрешено е да се променя обемът на тестовите и контролните проби, вижте инструкциите за използвания комплект реагент за амплификация.

Формуляр 1: REF К1-6-50-Mod / VER 27.12.16 / страница 9 от 15

18. Повторете процедурата по пране, следвайки параграфите. 15–16, отстранете напълно супернатантата.

19. Поставете епруветките с отворен капак в термостат при 64 °C за 5–10 минути, за да изсъхне универсалният сорбент.

20. Добавете 50–100 µl елуиращ буфер B към епруветките (вижте инструкциите за използвания комплект реагент за амплификация).

Въртете, докато сорбентът се ресуспендира напълно. Поставете в термостат с температура 64 °C за 5–10 минути, като периодично (1 път в минута) разбърквате на вортекс.

Пречистената ДНК може да се съхранява при температура от 2 до 8 °C за една седмица, при температура от минус 24 до минус 16 °C за 6 месеца и при температура не по-висока от минус 68 °C за една година. За да направите това, е необходимо, без да улавяте сорбента, да прехвърлите супернатантата в нова епруветка.

Формуляр 1: REF К1-6-50-Mod / VER 27.12.16 / страница 10 от 15

ИЗВЛЕЧВАНЕ НА ДНК ОТ ХРАНА, БИОЛОГИЧНИ ДОБАВКИ,

ХРАНА ЗА ЖИВОТНИ ИЛИ РАСТИТЕЛНА ХРАНА

ВНИМАНИЕ! За процедурата за приготвяне на биологичен материал за екстракция на ДНК и обема на тестовата проба вижте инструкциите към комплекта реагенти, използвани за амплификация

1. Загрейте лизиращия буфер и промивния разтвор 1, ако се съхранява при 2 до 8°C, при 64°C, докато кристалите се разтворят напълно.

2. Поставете епруветки от 1,5 ml с предварително обработени тестови проби в стойка (вижте инструкциите за използвания комплект реагент за амплификация за обем/количество на пробата).

3. Подгответе полипропиленова епруветка за еднократна употреба от 1,5 ml с капачка на винт или плътно прилепваща отрицателна екстракционна контрола (EC). Добавете 100 µl OKO към епруветката.

4. Добавете 400 µl лизиращ буфер и 17 µl лизиращ реагент към тестовите епруветки и OC.

5. Затворете плътно капаците, разбъркайте добре и разбъркайте капките на вортекс.

Поставете епруветките в термостат при температура 64 °C за 1 час, като периодично разбърквате (5 пъти на всеки 10–12 минути) или използвайте термостат-шейкър.

6. Утаете неразтворените частици на пробата чрез центрофугиране за 5 минути при 10 kg (напр. 12 krpm за микроцентрофуга MiniSpin, Eppendorf Manufacturing Corporation).

7. Изберете необходимия брой нови полипропиленови епруветки за еднократна употреба от 1,5 ml с капачки на винт или плътно прилепващи капачки.

8. Ресуспендирайте универсалния сорбент чрез интензивно разбъркване на вортекс. Добавете 25 µl ресуспендиран универсален сорбент към всяка епруветка с отделен накрайник, затворете плътно капаците.

9. От епруветките с лизирани проби отстранете супернатантната течност в обем от 200–350 µL много внимателно (като избягвате навлизането на суспендирани частици и мастни капки) с помощта на отделни накрайници с филтри и прехвърлете в епруветки със сорбент. Vortex, оставете в решетка за 10 минути, като разбърквате на всеки 2 минути.

Формуляр 1: REF К1-6-50-Mod / VER 27.12.16 / страница 11 от 15

10. Центрофугирайте епруветките в микроцентрофуга за 1 минута при 2 kg (напр. 5 krpm за микроцентрофуга MiniSpin, Eppendorf Manufacturing Corporation).

11. Без да хващате сорбента, отстранете супернатантата от всяка епруветка с отделен накрайник от 200 µl без филтър, като използвате вакуумен аспиратор.

12. Добавете 300 µl промивен разтвор 1 към епруветките, затворете плътно капаците, разбъркайте на вортекс, докато универсалният сорбент се ресуспендира напълно.

13. Центрофугирайте епруветките в микроцентрофуга за 1 min при 2000 g.

14. Без да хващате сорбента, отстранете супернатантата от всяка епруветка с отделен накрайник от 200 µl без филтър, като използвате вакуумен аспиратор.

15. Добавете 500 µl промивен разтвор 2 към епруветките, затворете плътно капаците, разбъркайте на вортекс, докато универсалният сорбент се ресуспендира напълно

16. Центрофугирайте епруветките в микроцентрофуга за 1 минута при 7 kg (напр. 10 krpm за микроцентрофуга MiniSpin, Eppendorf Manufacturing Corporation).

17. Без да хващате сорбента, отстранете супернатантата от всяка епруветка с отделен накрайник от 200 µl без филтър, като използвате вакуумен аспиратор.

18. Повторете процедурата по пране, следвайки параграфите. 15-16, отстранете напълно супернатантата.

19. Поставете епруветки с отворен капак в термостат при 64 °C за 5-10 минути, за да изсъхне универсалният сорбент.

20. Добавете към епруветките 50 µl елуиращ буфер B. Разбъркайте на вортекс, докато сорбентът се ресуспендира напълно. Поставете в термостат с температура 64 °C за 5–10 минути, като периодично (1 път в минута) разбърквате на вортекс.

21. Центрофугирайте епруветките в микроцентрофуга за 1 min при 10 хил. g. Супернатантата съдържа пречистена ДНК. Пробите са готови за PCR.

Пречистената ДНК може да се съхранява при температура от 2 до 8 °C за една седмица, при температура от -24 до -16 °C за 6 месеца и при температура Форма 1: REF K1-6-50-Mod / VER 27.12 .16 / стр. 12 от 15 не по-висока от минус 68 °С през годината. За да направите това, е необходимо, без да улавяте сорбента, да прехвърлите супернатантата в нова епруветка.

СРОК НА ГОДНОСТ, УСЛОВИЯ НА ТРАНСПОРТИРАНЕ И СЪХРАНЕНИЕ.

Най-доброто преди среща. 12 месеца Не трябва да се използва комплект реагенти с изтекъл срок на годност. Срокът на годност на отворените реагенти е срокът на годност на етикетите за неотворени реактиви, освен ако не е отбелязано друго в инструкциите.

Транспорт. Комплект реагенти трябва да се транспортират при температура от 2 до 8 C за не повече от 5 дни в термични контейнери, съдържащи пакети с лед, от всички видове покрити превозни средства. При получаване разглобете в съответствие с посочените температури на съхранение.

Съхранение. Съхранявайте комплекта реагенти при температура от 2 до 25 C, с изключение на лизиращия реагент. Съхранявайте лизиращия реагент в хладилник при температура от 2 до 8 С.

Хладилните камери трябва да осигуряват регулиран температурен режим.

Разтвор за лизиране 30 cm 3,

Измиващ разтвор 1 30 cm 3 ,

Концентрат за почистващ разтвор 2 20 cm 3 ,

Сорбентна суспензия 2 cm 3,

Буфер за елуиране на ДНК 4 cm 3 .

Оперативна процедура:

Пригответе промивен разтвор 2, за да направите това, смесете 20 cm 3 от концентрата от комплекта, 80 cm 3 дестилирана вода и 100 cm 3 96% етанол в отделна бутилка. Съхранявайте разтвора на стайна температурав плътно завинтена бутилка.

Проверете състоянието на сорбента - при утаяване той трябва да заема приблизително половината от обема на суспензията.

В плътно затворена полипропиленова епруветка от 1,5 cm 3 (за предпочитане с капачка на винт) добавете 100 µl от предварително приготвената тестова проба, отрицателна или положителна, добавете 300 µl лизиращ разтвор (към всяка проба с отделен накрайник) и разбъркайте добре чрез пипетиране 3-10 пъти.

Добавете 15 - 20 µl от ресуспендирания сорбент, разбъркайте добре на вортекс, поставете в стелаж за 5-7 минути за пълно утаяване на сорбента.

Утаете сорбента в микроцентрофуга за 30 секунди при 3-8 хиляди rpm. Вземете супернатантата от всяка епруветка с отделен накрайник (удобно е да използвате вакуумно засмукване).

Добавете 300 μl промивен разтвор 1, разбъркайте на вортекс, докато сорбентът се ресуспендира напълно (ако сорбентът се счупи слабо, разбийте го с пипета), утаете в центрофуга при 4-8 хиляди оборота в минута за 30 секунди. Изтеглете супернатантата от всяка епруветка с отделен накрайник.

Добавете 800 μl промивен разтвор 2, разбъркайте на вортекс, докато сорбентът се ресуспендира напълно, утаете в микроцентрофуга при 6-10 хиляди rpm за 30 секунди, вземете супернатантата.

Повторете стъпка 6, внимателно изберете супернатантата, изсушете утайката от сорбента в термостат при 65°C за 5 минути.

Ресуспендирайте сорбента в 30-40 µl елуиращ буфер, поставете в термостат при 65°C за 5 минути, като периодично разбърквате.

Утаява се в микроцентрофуга при максимална скорост от 1 минута.

Пробата е готова за PCR, супернатантата съдържа пречистена ДНК.

Като отрицателна контрола на етапа на екстракция на ДНК е необходимо да се използва физиологичен разтвор или дейонизирана вода.

Ефективността на екстракцията на ДНК с помощта на комплекта DNA-sorb-PCR е 30–60%.

клиничен материал	Плазма, серум	Остъргване, сперма, фарингеални промивки, урина	Биопсия, кръв, изпражнения
Брой пипети
Обем на сорбента
Скорост на утаяване на сорбента	8 хиляди оборота в минута	6 хиляди оборота в минута	3-4 хиляди оборота в минута
Обем на елуента
Ефективност на извличане на ДНК

5.2. Етап 2. Състав на PCR настройка на комплекта за PCR амплификация:

5x реакционен буфер 1000 µl (вискозен бистър син разтвор)

Дейонизирана вода.2000 µl

Нуклеотидна смес.500 µl

Taq полимераза.100 µl

Грунд смес.500 µl

Восък за PCR.2000 µl

Положителна контрола 100 µl

Отрицателна контрола 100 µl

Минерално масло 4000 µl

Комплектът се съхранява при минус 20°C за една година.